圆二色光谱CD光谱.PPTVIP

圆二色光谱（CD光谱） 主要内容 预备知识 预备知识 圆二色性 当光通过光学活性物质时，介质对左右旋圆偏振光的吸收率不同，二者的差称为该物质的圆二色性（circular dichroism，简写为CD）。 圆二色光谱 光学活性物质对左右旋圆偏振光的吸收率之差 是随入射偏振光的波长变化而变化的。以 或有关量为纵坐标，波长为横坐标，得到的图谱。 由于 绝对值很小，常用摩尔椭圆度 来代替，二者的关系是： 圆二色光谱 当光学活性化合物对光没有特征吸收时，在谱图中仅为一条近似水平的直线。 当光学活性化合物对光存在特征吸收时，通常有两种情况：当 时，得到一个正性的圆二色光谱曲线；当 时，得到一个负性的圆二色光谱曲线。 圆二色光谱仪的基本构造 圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用 蛋白质的圆二色性 (1)由氨基酸通过肽键连接而成； (2)光学活性基团：肽键、芳香氨基酸残基、二硫桥键； (3)蛋白质有多个结构层次，相同的氨基酸序列，因蛋白质的折叠结构不同，基团的光学活性受到影响。 蛋白质的圆二色特征 (1)光学活性基团及折叠结构； (2)250nm以下的光谱区，肽键的电子跃迁引起； (3)250~300nm光谱区，侧链芳香基团的电子跃迁引起； (4)300~700nm光谱区，蛋白质辅基等外在生色基团引起。 蛋白质CD光谱分析——定性分析 蛋白质CD光谱分析——定性分析 蛋白质CD光谱分析——定性分析 蛋白质CD光谱分析——定量分析 基本原理： 假设蛋白质在波长λ处的CD信号是蛋白质中各种二级结构组分的线性加和，则有等式： 蛋白质CD光谱分析——定量分析 计算方法和拟合程序： 已报道的计算方法和拟合程序较多，按先后分别有： 多级线性回归：拟合程序为GF，LINCOMB，MLR； 峰回归：拟合程序为CONTIN； 单值分解：拟合程序为SVD； 凸面限制：拟合程序为CCA； 神经网络：拟合程序为K2D； 自洽方法：拟合程序为SELCON；以及最近发展的一种联用方 法，拟合程序为CDSSR 。 蛋白质CD光谱分析——定量分析 SELCON：Sreermna和Woody在原有的一些算法上进行改进得到，其新的计算程序为SELCON3 程序采用自洽算法，假设待测蛋白质的二级结构与某种已准确测定结构的参考蛋白质相同，用测量的CD谱取代参考蛋白质的CD谱，用单值分解算法(SVD)和多种局部线性化模型，反复计算取代后的收敛性。 CONTIN：由Provencher和Glokner提出，最新的拟合程序是CONTIN／LL。该方法采用峰回归算法，假设待测蛋白质的CD光谱是N个已知构象的参考蛋白质CD光谱的线性组合，进行拟合计算，使下面函数的值最小。 蛋白质CD光谱分析——定量分析 CDSSTR： Johnson综合了几种方法的特点，发展起来的一种新的计算拟合方法。其特点是只需要最少量的参考蛋白质，就能得到较好的分析结果。拟合计算时，先从已知精确构象的蛋白质中任意挑选，组成参考蛋白质。每次组合结果应满足3个基本选择条件： (1)各二级结构分量之和应在0.95~1.05之间； (2)各二级结构的分量应大于-0.03； (3)实验光谱与计算光谱间的均方根应小于0.25。 最后的拟合结果是能满足以上3个规则所有结果的平均值。 CD测量的样品准备及条件选择 测试用的蛋白质样品中应避免含有光吸收的杂质，缓冲剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查，透明性极好的磷酸盐可用作为缓冲体系。 CD光谱的测量一般在蛋白质含量相对低(0.01~0.2g/L)的稀溶液中进行，溶液最大的吸收不超过2。 溶液浓度的测定：紫外光谱法、定量氨基酸分析；缩二脲方法、测氮元素的浓度、考马斯亮蓝染料结合比色法、在完全变性条件下测芳香氨基酸残基的吸收。（《蛋白质分子基础》高等教育出版社） 测试条件：环境温度 25℃， 相对湿度60%。 CD测量的样品准备及条件选择 例: 扫描波长范围（Range）250 ~190 nm； 辨析率（Resolution）0.5 nm ； 波长宽度（Band width）1.0 nm； 灵敏度（Sensitivity）20mdeg ； 响应度（Response）0.5 sec； 扫描速度（Speed）200 nm/min； 扫描次数（Accumulation）6。 * 预备知识 1 圆二色光谱 2 圆二色光谱仪的基本构造 3 CD光谱在蛋白质结构研究中的应用 4 蛋白质CD光谱图的分析 5 CD样品制备及条件选择 6 平面偏振光: 振动方向保持不变（