分子生物学方法 - 没有幻灯片标题研究报告.pptVIP

第六章 第八节 分子生物学方法 及其在中医研究中应用;（2）保持中医药优势的需要 几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成分，开发新药，不然势将失去优势。通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质量稳定、占用耕地、有效成分和若干有效成分最佳组合的探索、有效成分得率需要提高，以及服用的安全、方便等均有赖于大量的中药学基础研究，而已有的研究表明，分子生物学是十分重要、有效的研究手段。;中药的研究有赖于中医基础的研究，而不加强分子生物学技术对中医基础的研究，没有强大的基础研究的积累和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。 （3）继承和发展中医基础理论的需要 中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法）的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录与表达的调控。已有的研究表明，中医药的取效，往往是通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转录调控，进行补偿，达到治疗疾病的目的。深入研究对于阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的继承和发展，这部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头。;二．分子生物学的主要技术和方法 （一）载体 载体的使用目的： 1）重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难，所以载体重组技术倍受青睐。 ;2）DDPCR产物的克隆和测序。 3）RACE PCR产物的克隆和测序。 4）构建基因库、cDNA库，等。 5）基因功能检测。 6）基因工程（包括基因治疗之类）。 1．质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可方便的插入目的DNA片段。2）对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗生素抗性基因。; 这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子生物学中应用最为广泛的载体。;2．λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA为一双链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。实验用λ噬菌体，在其DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段，如有的λ噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等。 ;左上：质粒载体。左下：λ噬菌体载体。右质粒重组示意图。;（二）分子克隆常用酶 1．限制性内切酶（限制酶）。限制酶能特异性地结合于一段该酶能识别的特殊DNA序列之上或这一DNA附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端： （1）粘端。许多限制酶在二重对称轴的5′侧切割底物DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的粘端的DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如下： ↓ 5’N N N N N C T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T C N N N N N5’