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细胞生物学实验实验42015/4/13 实验4 细胞骨架的显示及观察 姓名：李思露 学号：131140040 实验目的 掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞骨架的原理和方法。 了解免疫荧光法检测细胞成分的原理和方法。 实验原理 细胞骨架：指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediated filament，IF）。 微管微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约 20~26nm的长度不一的小管。分布在核周围， 呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细 胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋 白有α和β 两种。 α β异二聚体沿纵向聚 合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管 不稳定，对低温（冷冻）、高压等物理因素及 秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。紫 杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解 聚。 微丝：真核细胞内是主要由肌动蛋白（actin）组 成的直径为5～7nm的骨架纤丝。主要分布在细胞 质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞 运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白 分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋 白组成不同。肌动蛋白单体为球形，依次连接成链， 两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松 弛素B为微丝断裂剂。 中间纤维：直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋白组成的细胞骨架成分。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成 网，并扩展到细胞质膜，与质膜骨架相连结。 主要起机械支撑和加固作用。组成中间纤维 的蛋白：角蛋白，波形蛋白，结蛋白、神经纤 维，神经胶质纤维和核纤层蛋白。不同组织来 源的细胞，组成其中间纤维的蛋白质种类可能 不同。 研究细胞骨架的意义。 （1）了解细胞骨架与细胞各种功能行使之间的关系。 （2）了解理化因素是否通过影响细胞骨架对细胞功能产生影响，以便趋利避害。 （3）鉴定发育中的细胞及肿瘤的来源。 6. 显示细胞骨架的常用方法：考马氏亮蓝染色法、免疫荧光染色法、鬼笔环肽标记法。 （1）考马斯亮蓝染色法原理及特点 原理：用去垢剂Triton X-100处理细胞适宜时间，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解，剩下的纤维状细胞骨架蛋白比较稳定而不被溶解，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示其结构。 特点：非特异蛋白染色，不能区分微管、微丝、中间纤维 （2）免疫荧光染色法原理及特点 原理：用TritonX-100处理固定处理过 的细胞，可增加细胞膜通透性，使抗体 能够进入细胞内与细胞骨架蛋白结合。接 着用荧光素标记的抗骨架蛋白抗体便可通 过直接免疫荧光法或间接免疫荧光法显示 骨架。 特点：特异显示各种骨架蛋白 （3）鬼笔环肽标记法原理及特点 原理：鬼笔环肽可特异性地结合肌动蛋白，因此，用荧光素标记的鬼笔环肽可以显示微丝。 特点：灵敏，能特异显示微丝。 实验材料、试剂及用品 材料： 洋葱 试剂 （1）M-缓冲液。 （2）6mM磷酸盐缓冲液（pH6.8）。 （3）含1%TritonX-100的M-缓冲液。 （4）用M-缓冲液配制的3.0%戊二醛。 （5）0.2%考马斯亮蓝R250染液。 （6）0.9%氯化钠生理盐水。 （三） 用品 普通光学显微镜、荧光显微镜、水浴箱（ 37 ℃） 小剪刀、镊子、5mL一次性塑料注射器、胶头吸管、1.5mLEP管、1.5mL试管架 实验操作 考马斯亮蓝染色法显示洋葱鳞茎内表皮细胞骨架 材料准备：撕取洋葱鳞茎内表皮，裁成大小0.5cm×０.５ｃｍ的小片。 PBS平衡：放入盛有1mL 6mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）的EP管中，静置使材料下沉（完全浸透）；然后用胶头滴管吸弃液体。 TritonX-100处理：加1mL 1% TritonX-100溶液处理20min，然后用胶头滴管吸弃液体。 洗涤：用M-缓冲液洗涤3次，每次加1.5mL溶液浸泡5min，然后用胶头滴管吸弃液体。 固定：加1mL 3.0%戊二醛固定30min,然后用胶头滴管吸弃液体。 洗涤：用PBS洗涤3次，每次浸泡5min,然后用胶头滴管吸弃液体。 染色：用0.5~1.0mL 0.2%考马斯蓝R250染液染色10min。 洗涤：用蒸馏水洗涤数遍。 制备装片：给载玻片中央加1滴水，用镊子夹取样品在其中展开，然后加盖玻片。 显微观察：在普通光学显微镜下，洋葱细胞骨架为布满细胞的蓝色网状结构。 对照样品：①省去步骤（3），不用TritonX-100处理；②省去步骤（4）,