产紫杉醇活性菌的选育及发酵条件研究-生药学专业论文.docxVIP

成都中医药大学 成都中医药大学 2004 级硕士学位论文 中文摘要 紫杉醇是一种广谱、活性较强的抗癌药物，尤其是对子宫癌、卵巢癌、乳腺癌 具较好疗效。但其资源短缺，价格昂贵，其产量远远不能满足国内市场需求；巨大 的资源短缺使红豆杉的资源保护和可持续利用成为十分迫切的任务。依据植物与微 生物的共生理论，本文围绕寻找紫杉醇的新资源开展以下工作。 首先，从红豆杉的根及茎中，分离出42株内生真菌，77株内生细菌；真菌经形 态观察鉴定为1纲、4目、5科、18属。在目的分类水平上以丛梗孢目（Moniliales） 为优势种群，占总菌株数的 83.33 ％；齿梗霉属（ Olpitrichum ）、曲霉属 (Aspergillus)、木霉属（Trichoderma）为优势种群，分别占总菌株数的23.81％、 14.29％、11.90％。采用薄层色谱和高效液相色谱方法，对42株内生真菌和77株细菌 的代谢液和菌丝进行分析，在4株真菌和10株细菌的代谢液中发现有紫杉醇或其类似 物，通过菌种鉴定，首次在曲霉属（Aspergillus）的真菌中发现产紫杉醇的菌株，在 红豆杉内生细菌中发现含有同宿主相似或相同化学成分的菌株。通过比较色谱行为 选取真菌SPH-4和细菌ZMZ-7作为产紫杉醇微生物育种的出发菌株。 其次，对真菌SPH-4的微波诱变条件进行初步考察，制作了致死曲线，发现在 300s 时诱变效率最高，经过2次微波诱变后，紫杉醇的单位产量提高了近一倍。并 对细菌的微波诱变做初步研究，发现细菌在120s 时诱变效果最好。细菌ZMZ-7经过 微波、紫外、X-射线诱变后产量提高近10倍。 在此基础上，对 SPH-4 诱变后菌株 SPH-W2 的生理特性进行考察，确定最佳的 培养基为淀粉培养基，最佳的碳源为葡萄糖，最佳的氮源为蛋白胨；菌株在 28℃， 初始 pH 7 时代谢液中紫杉醇检出量较高。对菌株 ZMZ-7 诱变后菌株 ZMZ-u 的发酵 温度、pH 进行单因素考察，确定 ZMZ-u 发酵的最佳温度为 30℃，最适宜 pH 为自 然。 总之，通过上述的研究为寻求紫杉醇新的资源及其替代品的寻找工作提供参考 数据，也为下一步开展发酵工艺的优化提供参考。同时，产紫杉醇类似物内生细菌 的发现，丰富了植物与微生物共生理论的内容，为今后寻找新资源提供了有益的借 鉴，也为采用基因工程构建产紫杉醇工程菌，提供有意义的物质基础。 关键词：紫杉醇、内生菌、诱变育种、发酵 I II II Abstract Taxol is a type of the most effective anticancer drugs, especially for uterine cancer, ovarian cancer and breast cancer. The increasing clinical demands for active Taxol and the exhausted supply of natural Taxus, initial source of taxol, have spurred to produce these drugs or its substitute. This paper wants to track this question by entophyte fermentation based on the endosymbiosis theory. Firstly, entophytes, including 42 strains fungi and 77 strains bacteria, were isolated from the roots and stems of Taxus chinensis and the former were morphologically identified belonging to 18 genera, 6 families, 5 orders and 1 class. Moniliales, which includes 83.33% of the whole strains, was believed the dominant order. While Olpitrichum, Aspergillus, Trichoderma were believed the dominant genera, which may include 23.81%, 14.29%, 11.90% of the whole strains in respective. 4 strains fungi and 10 strains bacteria which could produce taxol were fou