病理科免疫组织化学技术员培训和技术操作规范方案.doc

WORD文档可编辑 技术资料 专业分享 病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范 一、病理科免疫组织化学技术员培训规范： 凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。 二、病理科免疫组织化学染色操作规范 1.免疫组织化学染色前的准备事项 (一)组织切片的制备 常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛） (二)抗体的选择、稀释和保存 （1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。 （2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度 （3）抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价 降低)。 （4）抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。 （5）抗体的稀释。 (1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。 (2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。 (3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。 (三)被检测组织内抗原的修复 （1）经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。 （2）抗原修复缓冲液。 (l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。 (2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。 （3）抗原修复的常用方法。 (l)胰蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化。 ②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。 ③37℃下温育20-40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。 ④蒸馏水冲洗，终止反应。 ⑤阻断内源性过氧化物酶。 ⑥进行免疫组织化学染色。（配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。） （2)胃蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化. ②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。 ③37℃下温育10-30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短). ④浸人蒸馏水，终止反应。 ⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。) （3)微波修复抗原法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 ②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 200ml，盖上具有小孔的盖子。 ③将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95℃)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。 ④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15-20min。 ⑤蒸馏水冲洗。 ⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 ⑦用TBS或 PBS液冲洗。 ⑧进行免疫组织化学染色。 (4)热水浴法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 ②向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95 -99℃(不沸腾)预热。 ③将组织切片插人已预热的容器内，温育20-40min。 ④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。 ⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。 ⑥蒸馏水冲洗。 ⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 ⑧用TBS或PBS液冲洗。 ⑨进行免疫组织化学染色。 （5)压力锅法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 ②向4-5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原