产木质素降解酶真菌的分离及其发酵条件的研究-微生物学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 I I 摘 要 木质素是由苯丙烷结构单元分子之间通过稳定的化学键形成的复杂芳香族 高分子化合物，由于其立体结构的复杂性，所以很难被水解。自然界中能降解木 质素的微生物主要有细菌、放线菌和真菌。其中真菌起着主要作用。真菌参与木 质素的降解作用酶主要是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，它们都是菌 体分泌的胞外氧化酶。这些氧化酶对多种污染物都表现出了广谱的降解作用，包 括酚类、多环芳烃、各种染料、五氯联苯等难降解物质，随着人类对环境污染 和资源危机等问题的认识不断深入，从自然环境中分离可降解污染物的微生物 并对它们所产污染物降解酶进行研究，是当代环境保护与经济发展的重大课 题，也是对当代科学技术提出的新要求。 本研究从自然界中分离纯化一些真菌菌株，研究了这些菌株产木质素降解酶 的能力，并对产木质素降解酶能力较强的菌株进行分类鉴定。通过液体发酵培养， 期望获得木质素降解酶酶活力高的发酵条件。主要结果如下： 1、木质素降解真菌的筛选。采用子实体组织分离法获得了 14 株纯菌株。以 固体平板上的显色反应为初筛，进行快速筛选木质素降解酶的产生菌，综合愈创 木酚氧化和苯胺蓝脱色结果，菌株 Ga2、S2 和 W1 在平板上显色明显，初步断定 这些菌株有较强的产木质素降解酶能力。复筛过程在液体培养条件下进行，对经 初步筛选有木质素降解酶产生能力的菌株进行液体发酵，测定其木质素降解酶活 力。 2、产木质素降解酶菌株 W1 的分子鉴定及其系统发育树的构建。提取其总 DNA，选用真菌通用引物 ITS 序列进行，进行 PCR 手段克隆扩增菌株 W1 的 5.8sRNA 及其两侧的转录间隔区(rDNA-ITS)，经与 GenBank 中已有的菌株序列比对，发现 与多株 Irpex lacteus 序列有较高的相似度，为确定它们间的进化关系，将 W1 与8株 I.lacteus 菌序列比对，随后借助软件 MEGA4.0 的邻接法构建了系统发育 树，由发育树可知，W1 与 I.lacteus XSD-2 亲缘关系最近。 II II 3、I.lacteus W1菌株的锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（LiP） 液体发酵条件的优化。（1）分别采用单因素试验、正交设计和响应曲面法，优化 I.lacteus W1菌株产MnP培养条件。单因素试验结果显示I.lacteus W1产MnP的最 佳碳氮源为葡萄糖、酵母粉，培养条件为28℃、pH5.5、120rpm/min。正交设计 指示影响MnP产量的3个主要因素分别为诱导剂Tween 80、酵母粉和葡萄糖。最优 培养基组合为葡萄糖15g/L，酵母粉0.2g/L，KH2PO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L， Tween 80 1g/L 。 经 正交设计优化试验 MnP产量提高至 67.7U/L，增加 67% 。 Plackeet-Burman设计得出影响MnP产量的3个主效应因素为Tween 80、酵母粉和 葡萄糖。经Box-Beheken design设计优化了3个主效应因素，预测了最佳产MnP 的条件为葡萄糖、酵母粉和Tween 80分别为17.67g/L、0.18g/L和1.40g/L。在优 化后的培养基上MnP产量为53.8U/L,是原培养条件下的1.26倍。（2）通过单因素 试验优化LiP产量。研究了不同浓度的葡萄糖和酒石酸铵浓度、诱导剂Tween 80 及温度、转速、培养液初始pH对LiP产量的影响，结果显示，最佳培养条件为葡 萄糖20g/L、酒石酸铵0.1g/L、添加0.5g/LTween 80初始pH为5.0的30℃静置培养。 在优化后的培养条件下LiP产量为33.7U/L，是初始值的1.31倍。 关键词：平板显色；ITS序列；乳白耙菌；正交设计；响应曲面 Abs Abstract Abstract Lignin, a group of aromatic polymer in nature, is built up by propane unit using stable chemical bond. Microorganisms in nature that can degrade lignin are mainly bacteria, actinomycetes and fungi, and fungi play a major role. The major enzymes involved in lignin degradation of fungi are lignin peroxidase, manganese peroxidase and laccase, which are extracellular oxidase secreted by fu