产热凝胶粪产碱杆菌的生理代谢研究-生物化工专业论文.docxVIP

恻叩州 恻叩州 州 AE， 州州Y 摘要 热凝胶是由粪产碱杆菌或土壤杆菌发酵产生的一种新型微生物胞外多糖，其安全无 +毒并且具有独特的理化性质，可广泛应用于食品、医药和化工等领域。热凝胶的发酵过 程属于典型的生长非偶联型，发酵液中氮源耗尽后才开始合成多糖。由于氮源的缺乏， 使得热凝胶合成期间细胞内相关酶的合成及其活性的恢复受到极大的限制，造成热凝胶 合成速率的降低和发酵过程控制的困难。本文以高产热凝胶粪产碱杆酶 wxωC12 为研究 对象，运用蛋白质组学技术，对热凝胶发酵过程中，氮源耗尽前后菌体总蛋白的表达变 化进行了分析和鉴定:并且比较了樊产碱杆菌及其 ntrC 突变株生理代谢水平的差异， ntrC 基因是氮源代谢调控组分 N位C 蛋白的编码基因，从而对 N位C 蛋白在调控热凝胶合 成中的作用有了初步认识;另外本文还研究了Mn 2 对热凝胶合成的影响情况，以了解 + Mn2+在菌体生理代谢中的作用。 本文首先确立了蛋白分辨率高且重复性较好的粪产碱杆菌菌体总蛋白双向电泳图 谱的构建方法:使用蛋白质裂解液提取菌体总蛋白，然后选择 pH 4-7 的 IPG 预制干胶 条和适宜的等电聚焦程序进行第一向等电聚焦电泳，最后比较了考马斯亮蓝和硝酸银两 种染色方法对双向电泳图谱的影响。 随后利用上述构建的方法分别对热凝胶发酵过程中氮源耗尽前后的菌体总蛋白进 行双向电泳分析，用 PDQuest 8.0.1 软件分析得电泳图谱中共有 20 个蛋白表达水平发生 显著变化。选取其中 5 个蛋白进行质谱鉴定，成功鉴定出 3 个巳知功能的蛋白，其中烯 瞅 ACP 还跟酶与菌体生长受阻有关。 另外，本文还对粪产碱杆菌和其 ntrC 突变株的商体形态和热凝胶生产特性进行了 比较。与原始菌株相比 ，ntrC 突变株培养 18 h 后菌体形态有很大不同:并且其菌体生 长和热凝胶合成的能力显著降低，证明了 ntrC 基因在热凝胶合成中具有重要的调控作 用。同时采用双向电泳技术对 ntrC 突变株和原始菌株的菌体总蛋白进行分析发现布约 40 个蛋白没有在 ntrC 突变株中表达，有的个蛋白表达水平发生显著变化。通过飞行质 谱成功鉴定得 4 个表达水平显著变化的蛋白，其中的 N- 乙瞅叩·谷氨瞅磷酸脱氢酶和核 背二磷酸激酶与氮源代谢和热凝胶合成有关。 Mn2+对热凝胶合成影响的研究结果表明，摇瓶发酵 18 h 时提高培养基中MnCh 浓 度至 0.13 圳n 热凝胶产量提高到 22.3 gIL，与对照组相比提高了 45.3%。并且通过测定 菌体胞内 UDP-Glucose 的含量发现，提高Mn2 浓度眉胞内 UDP Glucose 含最总体降低， + +由此推测Mn2 对热凝胶合成的关键酶糖基转移酶的活性有一定促进作用。 + +;州州州num阳川A唔州附 +; 州州州nu m阳川A唔 州附川AWW M川川AE 川川川adv 州川川00  UDP-Glucose Abstract Abstract Curdlan is a new kind of microbial exopolysaccharide synthesized by Alcaligenes faecalis or Agrobαcterium sp. The unique rheological and thennal gelling properties of curdlan can be applied advantageously to the fields of food，pharmaceutical and architecture. Curdlan w邸 synthesized under nitrogen-limited condition，the synthesis and activity of intracellular e皿yme was greatly restrained at 由.e condition， leading to the decreasing productivity of curdlan and the hard control of fermentation process. ，nI this s仙似 we first investigated the to阳1 protein expression change of Alcaligenes faecalis when the condition changed 仕om nitrogen-sufficient to nitrog四-limited by two-dimensional electrophoresis (2-DE). Then