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PAGE PAGE 20 医学遗传学实验讲义 浙江大学医学院 医学遗传学课程组 2011年9月2日 实验一 人类外周血染色体标本制备 一、实验目的 通过实验了解和掌握人类外周血染色体标本培养和制备的基本方法。 二、实验原理 正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）或其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。这样经过短期培养（colchicine），秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 三、实验准备 实验材料 人外周血 （淋巴细胞） 实验器具 离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头（6 1/2号）、吸管、量筒、火柴、酒精灯、pH计、研钵、饭盒、超净工作台、镊子、载玻片、玻片盒、烧杯、染缸、试管架、玻璃铅笔或记号笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。 药品和试剂 1．培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80% 小牛血清(56℃水浴灭活30分钟，灭活可破坏补体及一些污染的病毒) 20% 植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质,可用培养基溶解) 4% 青霉素终浓度 　 100U/ml 链霉素终浓度 　100U/ml 用3.5%NaHCO3调pH7.0～7.2，用玻璃滤器，抽滤灭菌。在超净工作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5 ml）。培养液置于-20℃冰箱保存。使用前从冰箱中取出，温育至 2．肝素 浓度为0.2%，作为抗凝剂使用。200 mg肝素粉末溶于100 ml生理盐水中。高压灭菌，-4℃冰 3．KCl 浓度为0.075 M，0.559 4．秋水仙素 10 ?g/ml，作为有丝分裂的阻止剂，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称取10 mg秋水仙素溶于100 ml生理盐水中，配成100 ?g/ml的原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存备用。临用时取上述原液用生理盐水稀释成10 5．甲醇 6．冰醋酸 7．吉姆沙(Giemsa)染液 吉姆沙原液：先将0.5g吉姆沙粉末干研磨，时间越长越好；加33 ml 60℃预热的纯甘油，在研钵中研磨，放在60℃ 1份Giemsa原液＋9份磷酸缓冲液 8．磷酸缓冲液(pH 6.8) 溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078 溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876 100ml缓冲液：需溶液A50.8 ml，溶液B 49.2 ml。 四、实验步骤 1．采血 先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取2 ml干燥灭菌注射器，配上针头（6 1/2号）并吸取肝素液0.2 ml湿润针筒，采静脉血2 ml，转动针筒使血与肝素混匀。 2．培养 采血完毕立即将针头插入含RPMI 1640培养瓶内（瓶盖预先用酒精棉球消毒），每瓶滴入30滴血，摇匀。2 ml血可分装三至四瓶。置37℃ ? 0.5 3．秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前2~3小时，加入秋水仙素，6 1/2号针头3滴（每ml约60滴），使细胞分裂终止在中期。秋水仙素的浓度不宜过高和作用时间过长，虽然这样做可以得到较多的分裂相，但导致染色体过分缩短，不宜用于显带分析。 4．离心