分子生物学课件-分子生物第六章.ppt

第六章 分子生物学技术 内容 1、 核酸提取与鉴定 2、 印迹杂交技术 3、 聚合酶链反应 4、 重组DNA技术 5、 转基因技术与基因打靶 研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等 核酸提取与鉴定 第一节 核酸提取 总原则： 保证核酸一级结构的完整性 避免杂质污染 核酸提取过程 一、质粒DNA 质粒 (Plasmid)是游离于细菌 (及个别真核细胞)染色体DNA之外、能自主复制的遗传物质 多数是一种闭环DNA，大小为1-300kb，能够转化细菌，是基因载体 提取质粒DNA包括三个基本步骤 1·培养细菌和扩增质粒 在培养基中加入抑制剂 (例如氯霉素)可以抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细胞分裂，而质粒DNA会继续复制，拷贝数可达3000个，这一过程称为质粒扩增 如果要扩增的质粒DNA携带氯霉素抗性基因 (CmR)，可以用壮观霉素替代氯霉素 2·收获和裂解细菌 ①机械法:超声波、玻璃珠等（易引起DNA断裂） ②化学试剂法:十二烷基硫酸钠 (SDS)等（单用难以充分裂解） ③溶菌酶-化学试剂联合法:先用溶菌酶消化，再用化学试剂处理（最常用） 3·分离纯化质粒 关键：除去染色体DNA 质粒DNA特性： ①相对较小（仅为染色体DNA的0.1%-2%） ②闭环（染色体DNA大量断裂并且呈线性结构） 提取方法：氯化铯密度梯度分离法、碱裂解法、煮沸裂解法等 （1）