实验三超氧化物歧化酶提取及活性测定.pptVIP

生物技术综合实验 实验三 超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定 一、目的和要求 通过植物材料（玉米）超氧化物歧化酶（SOD）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质及超滤浓缩蛋白质的方法和原理。 二、实验原理 超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于植物体内，它是一种重要的自由基清除剂，对生物体有多种保护作用。超滤是一种蛋白质浓缩方法，只要选择适当的滤膜可将玉米浆中的SOD与其他小分子杂蛋白、可溶性糖等分离。 三、材料与试剂 1. 材料 玉米籽粒 2. 主要试剂 1、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）,500mL 2、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 3、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 4、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 5、0.1mol/LEDTA溶液 2.3 仪器 恒温水浴锅、 冷冻高速离心机、 可见分光光度计、 研钵、玻棒、烧杯、量筒，等。 四、操作步骤4.1 SOD粗提液的制备 1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣或玉米种子，置于研钵中研磨。 2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。 3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。 4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。 3.2 SOD活性测定 试剂（mL） 空白对照管 样品管 碳酸缓冲液 5.0 5.0 EDTA溶液 0.5 0.5 蒸馏水 0.5 — 样品液 — 0.5 混合均匀，在30℃水浴中预热5min，测定OD480 3.3 结果计算 总酶活力=酶液总体积X稀释倍数/抑制50%的酶液量X样品重 五、本实验教学内容的重点和难点 重点：粗提液的获得玉米SOD的提取 难点：提取条件的控制 六、本实验教学内的深化和拓展 通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物SOD与动物SOD的区别，了解植物SOD的优势。 七、思考题，完成实验报告 1 什么是分段盐析，为什么要分段盐析？ 2 SOD有哪些用途？ * *