核磁共振代谢组学的方法的研究雷公藤红素对大鼠糖尿病溃疡促愈合的作用机制.docVIP

核磁共振代谢组学的方法的研究雷公藤红素对大鼠糖尿病溃疡促愈合的作用机制 　　摘 要 采用腹腔注射链脲佐菌素结合打孔器皮肤烫伤构建SD大鼠糖尿病溃疡模型，随机分为正常创面生理盐水处理组、 糖尿病溃疡模型生理盐水处理组、 糖尿病溃疡模型雷公藤红素处理组，溃疡创面持续给药处理14 d，利用基于核磁共振的代谢组学方法研究雷公藤红素处理后大鼠糖尿病溃疡组织代谢特征，并结合形态观察计算溃疡愈合率及组织病理学检测（HE染色、 Masson染色）技术研究大鼠糖尿病溃疡的愈合情况，揭示雷公藤红素对大鼠糖尿病溃疡的治疗作用及其机制。研究结果表明，雷公藤红素可诱导大鼠溃疡创面上皮再生化，调节炎性细胞浸润和胶原纤维分布，促进溃疡创面愈合。经偏最小二乘法分析，筛选并鉴定出20种潜在内源性差异代谢物。代谢通路分析表明，雷公藤红素能够显著提高溃疡组织三羧酸循环水平，促进其能量供应，加快蛋白合成，改善线粒体功能和氧化应激水平，加速皮肤组织的自我修复能力，促进糖尿病溃疡的愈合。本研究为雷公藤红素作为治疗糖尿病溃疡新药研究提供了参考。 　　关键词 雷公藤红素； 糖尿病溃疡； 核磁共振波谱； 代谢组学 　　1 引 言 　　糖尿病溃疡是糖尿病常见的慢性并发症之一，溃疡创面愈合延迟或不愈合、 愈合后创面反复发作，极易导致糖尿病患者致残和早亡[1]。糖尿病溃疡创面常伴随着炎症修复，然而过度炎症会影响创面肉芽形成，导致组织脆弱和上皮形成迟滞，最终加重溃疡创面难愈合和导致并发感染[2]，如何调控创面炎症修复已成为临床治疗糖尿病溃疡亟需解决的难点和重点问题[3，4]。 　　中药雷公藤中提取的活性成分雷公藤红素（Celastrol，Cel）具有抗肿瘤、 抑制免疫反应和抗炎症作用、 抑制血管生成等多种药理作用[5～7]，特别是优良的抗炎及调控成纤维细胞增生及胶原蛋白合成的药理作用[8，9]，在促进创面愈合方面显示了其潜在应用价值。然而雷公藤红素在治疗糖尿病溃疡方面的应用尚未见相关研究报道。 　　代谢组学重点关注生物体系受疾病侵袭、 药物干预、 环境变化等外界刺激下所产生的代谢应答变化规律，广泛应用于疾病诊断、 药物毒性评价、 作用机制和基因功能研究[10，11]。 与色谱质谱联用技术相比，核磁共振（NMR）技术具有非侵袭性、 非样品破坏性、 高分辨率和结果稳定、 重现性好的特点，在生物样本的微量检测和无损检测以及组织样本的原位检测方面是不可替代的分析手段[11，12]。鉴于此，本研究通过基于NMR的代谢组学技术和组织病理学检测技术，系统考察了雷公藤红素对糖尿病溃疡的治疗作用，并初步探讨其可能的作用机理，以期为雷公藤作为治疗糖尿病溃疡的新药研究提供实验依据。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　罗氏血糖仪（德国罗氏公司）； AL104电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）； MilliQ 超纯水系统（美国Millipore公司）； Bruker AVANCE III 600 核磁共振谱仪（美国Bruker公司）； 5415R低温离心机（德国Eppendorf公司）； BX51 系统显微镜（Olympus公司）； SCIENTZ49高通量组织研磨器（宁波生物科技股份有限公司）。 　　雷公藤红素（批号CE150811，成都健腾生物技术有限公司）； 链脲佐菌素（Streptozocin， STZ，SigmaAldrich公司）； 柠檬酸、 柠檬酸钠、 水合氯醛（上海国药集团化学试剂有限公司）； D2O （99.9%氘代，剑桥同位素实验室）； HE染色试剂盒、 Masson染色试剂盒（南京凯基生物科技有限公司）。SD 雄性大鼠（体重180～220 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司），实验动物许可证编号为 SCXK 　　2.2 动物实验 　　2.2.1 糖尿病大鼠溃疡模型的制备 本研究经温州医科大学动物伦理委员会批准。SD雄性大鼠饲养在温州医科大学实验动物中心，单笼饲养，室温（22±3）℃，相对?穸?50%±10%，12 h 交替照明，自由饮水、 进食。适应喂养7 d，随机抽取8只SD大鼠作为正常组，其余16只作为糖尿病造模组。过夜禁食13 h后，造模组注射新鲜配制的STZ 柠檬酸钠混悬溶液（60 mg/kg， i.p.），正常组给予同体积的柠檬酸钠混悬溶液（0.10 mol/L， pH 4.5），3 d后尾静脉采血测血糖，当血糖值大于16.7 mmol/L 且伴随出现“三多一少”症状者即为糖尿病造模成功[13]。再经过1周观测大鼠饮水饮食状况并记录血糖值后，进行糖尿病溃疡模型制作。 　　选取上述16只糖尿病大鼠，根据文献[14＼]报道的方法构建大鼠溃疡模型。即首先用10%水合氯醛腹腔麻醉后，背部剃毛，常规消毒，将打孔