人教版2017年高一生物1基因重组与基因工程教学课件.pptVIP

左下角处有超级链接到配伍末端 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 3.　cDNA文库　 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 　　是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。 4. 聚合酶链反应（PCR） 模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。 PCR的反应体系　 （1）变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。 PCR的基本反应步骤及原理　 　　 　　　　　　 PCR反应条件　 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 　 　 PCR反应的基本原理 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 　3′ 5′ 　　　　　5′ 3′ A(A)nA 　A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 　1. 直接选择法 　(1) 抗药性标记选择 　(2) 标志补救(marker rescue) 　(3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 　2. 免疫学方法 　如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插入失活法) 抗药性标记选择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 α 互补的检测 原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制