全日制研究生分子生物学 PCR技术.ppt

* Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * （三）多重PCR（multiplex PCR） PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。 多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 乳头瘤病毒（ＨＰＶ）检验及分型 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性中仅次于乳腺癌。我国每年有宫颈癌新发病例１３.１５万，占世界宫颈癌新发病例总数的２８.２％。 临床科学研究表明，ＨＰＶ持续感染是导致宫颈癌的直接原因。ＨＰＶ可分为高危型和低危型两种，不同的ＨＰＶ亚型在致癌性方面存在很大的差别。至今发现的ＨＰＶ病毒约有１２３种，至少有２０种高危型ＨＰＶ会构成子宫颈癌。所以提早诊断ＨＰＶ感染，对ＨＰＶ尤其是高危型ＨＰＶ进行检验和分型极为重要。 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * （四）重组PCR（recombinant PCR） 将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接。 其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段的部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 引物a 引物c 引物b 引物d 5 3 PCR 混合，变性和复性 延伸 异源部分双链DNA形成 5 5 5 5’ 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 PCR 引物a 引物d 再次 PCR 5 5 3 3 （四）重组PCR（recombinant PCR） * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * （五）锚定PCR（anchored PCR，APCR） 用于扩增已知一端序列的目的DNA 例如，T细胞受体和免疫球蛋白基因5端具有高度可变性。 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * （六）不对称PCR（asymmetric PCR） 其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50～100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * 已知序列 PCR 用途： 未知序列的研究 限制酶切点（X） 限制酶切点（X） 限制酶 X酶切 连接 未知序列 （七）反向PCR（inverse PCR） * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics * （八）定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR） 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 定量PCR定量的理论依据：理想的扩增结 果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量， X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数； 理 论上PCR扩增效率为 100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一 次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈 2 的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n ，其 中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是 固定不变的。通常X 在 1～105 拷贝、循环次数n≤30 时，E 相