分子生物学-DNA复制幻灯片.pptVIP

第二章 基因的分子特性 第一节 遗传物质特性 ☉ 核糖The sugars of nucleic acids 第二节 DNA结构 以中心为轴，向右盘 旋（直径2nm） 碱基是扁平结构，位于内部，成对且垂直于螺旋轴 双 螺 旋 中 存 在大，小 沟 4.双螺旋结构的基本形式 超螺旋状态的描述 第三节 DNA的物理、化学性质 一、DNA分子变性 (DNA denaturation) 注意事项: ①DNA的GC含量同样影响其密度 ② OD260的应用： DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40 μg/ml单链DNA 33 μg/ml寡核苷酸 判断核苷酸样品的纯度 DNA纯品：OD260/OD280=1.8 RNA纯品：OD260/OD280=2.0 三、Molecular Hybridization (核酸, 蛋白质分子杂交) 2、分子杂交的检测 传统和现代杂交实验示意图 DIG分子示意图 学生杂交实验结果 JM83 DNA (EcoRV) JM83 DNA (BglI) JM83 DNA (NcoI) pMD-phoA lasmid DNA (BamHI/PstI) M. Marker Western印迹（免疫印迹） 第四节 真核生物DNA序列类型 限制性内切核酸酶概念 限制性内切酶可以将DNA剪切成特定的片段 PCR-STR——第二代DNA指纹技术 用于亲子鉴定的STR位点的基本情况 生物相对复杂性与 二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation） DNA复性概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。 复性并不是两条单链重新缠绕这样的简单过程。它首先从单链分子的无规则碰撞运动开始，这种碰撞过程是随机的，与DNA的浓度，溶液的温度和离子强度有关。有时两条单链之间非对应的某一小段碱基之间也能形成氢键，但总的来说，这样的安排使链上的大部分碱基都不能互补。这样的碰撞可能多次发生，但所形成的氢键都是短命的，很快会被分子的热运动所瓦解。只有当应该配对的一部分碱基相互靠近时，一般认为需要10个一20个碱基对．特别是富含G．C的节段首先形成氢键，产生一个(或几个)双螺旋核心(这一步叫成核作用，nucleation )；然后，两条单链的其余部分就会像拉拉链那样迅速形成双螺旋结构(这一步叫做拉链作用，zippering )。因此，复性过程的限制性因素乃是分子碰撞过程大部分变性但还没有完全变性的DNA会迅速地复性，也就是因为这一过程中不大需要这样一个碰撞过程。完全变性DNA一般需要几个小时才能复性。需要注意，复性DNA分子不一定是原有的一对互补链，可以说，大部分复性DNA分子都不是原 配的! Southern blot： S.S. DNA × S.S. DNA Northern blot：S.S. RNA × S.S. DNA Western blot： Protein (antigen ) × antibody 原位杂交：在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子的特点，应带有标记的DNA或 RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸 (RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。 3、 DNA一级结构的特点 a、脱氧核糖是其显著特点－－－－DNA极其稳定的根本原因 DNA在高pH值时磷酸键非常稳定，只是存在构象的变化。 核酸中五种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可以发生酮式一烯醇式或氨基亚氨基之间的结构互变。这种互变异构在基因的突变和生物的进化中具有重要作用。 RNA 在高pH时则稳定性很差,由于2‘－OH导致的水解 研究DNA变性过程的方法很多，导致变性的方法主要是加热变性和用变性剂处理。测量变性的方法很多，有分光光度法．流体力学法，量热法，极谱法，旋光色散法，圆二色性法，层析法等。使用最为广泛的方法是光吸收法(260nm)，然而圆二色性法也是非常有希望的方法，它能提供足够的信息以补充光吸收法的不足之处，由于DNA中的碱基的嘌呤环和嘧啶环中的转变，在260nm有