生物技术常用技术pcr技术及应用.pptVIP

必须的仪器设备 （三）、 PCR 扩增产物的检测方法 凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法 、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP） 核酸探针杂交法 PCR产物测序 PCR-OLA（PCR-oligonucleotide ligation assay) 荧光PCR 1.琼脂糖凝胶电泳 制胶 加样 电泳 紫外光检测 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 特点： 分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； 上样量远大于琼脂糖凝胶； 回收的DNA纯度高； 采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。 用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。 3.PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)  据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符。 用途： 传染病病原体基因分型 人类基因的变异性研究。 4. 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP） 将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。 5.核酸探针杂交法 ?点杂交 反向点杂交 微孔板杂交 Southern印迹杂交 ①点杂交（dot blot） 原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。 探针： 放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。 非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快 用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 ②反向点杂交(reverse dot blot) 原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。 探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。 用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。 结果分析： 正常纯合子 突变纯合子 杂合子 ③微孔板杂交( microplate hybridization) ④ 荧光探针杂交法 目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、复合探针法等。 （定量PCR详述）。 ⑤Southern印迹杂交(Southern blot)  6. PCR-ELISA 引物双标记：生物素/地高辛、荧光素 引物5’端标记生物素+RNA探针标记地高辛 将一寡核酸探针固定于微孔板作为捕获探针，变性的PCR产物单链的某一区域与之杂交后，此单链间接地固定于微孔板上。再用一非放射性标记物标记（如生物素）的检测探针与固定于微孔板的PCR产物单链的另一区域杂交。 7. PCR产物测序 方法： 双脱氧核苷酸链末端终止法 化学裂解法 用途：目前一般多用于科研 PCR常见问题之一 无扩增产物 PCR常见问题之二 PCR常见问题之二 PCR常见问题之三 PCR常见问题之三 PCR常见问题之四 引物二聚体 两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3’端有互补区。 引物模板比例太高，可增加模板用量。 退火温度过低。 热循环次数过多。 9.7 PCR技术的发展 巢式PCR（nested PCR ） 逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 重组PCR(recombinant PCR) 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不对称PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 定量PCR （3）多重PCR(multiplex PCR) （4） 重组PCR(recombinant PCR) （5） 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） （6）不对称PCR（asymmetric PCR） 基本原理：采用两条不同浓度的引物，即