噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定..doc

噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定 】 目的：从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗 血管内皮生长因子(VEGF) mAb阿瓦斯汀(Avastin)特异性结 合的多肽.方法：用Avastin为靶分子，对噬菌体12肽库进 行3轮生物淘洗，随机挑取80个克隆，ELISA法鉴定其亲和 性，将亲和性高的阳性克隆进行DNA序列测定，推导与噬菌 体外壳融合的12肽氨基酸序列.Fmoc固相法合成12肽，戊 二醛交联12肽与血蓝蛋白，打点印迹检测偶联物能否与 Avastin结合.结果:ELISA显示，42个噬菌体克隆与Avastin 有较强的亲和性，测序发现41个阳性克隆表迗的融合12肽 的序列一致，1个不同；化学合成的1 2肽能与Avastin特 异性结合，1 2肽 KLH偶联物也能与Avasti n特异性结合. 结论：初步证明12肽模拟了 VEGF部分表位. 关键词】Avastin(bevacizuma b)细菌噬菌体肽库血 管内皮生长因子交联 0引百 血管生成是肿瘤生长和转移的前提[1].血管内皮生长 因子(VEGF)是促进血管形成过程中的关键因子[2-3].肿瘤 组织中VEGF表迗水平与肿瘤血管化的程度、恶性程度呈正 相关[4-5].因此，VEGF是肿瘤抗血管生成治疗中比较理想 的靶分子.噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可 作为任何靶抗原表位的模拟肽，运用肽库筛选时不需要靶蛋 白的任何结构，只需靶抗原的mAb就可以获得具有免疫原性 和抗原性的多肽，它们反映了抗原结合位点的特定的构像 [6-7].我们利用抗VEGFmAb阿瓦斯汀对噬菌体随机1 2肽 库进行亲和筛选，旨在筛选出能与A vastin有高亲和力的噬 菌体克隆，并分析其展示的多肽序列能否模拟VEGF的表位. 1材料和方法 材料抗VEGFmAbAvastin（罗氏公司）;噬菌体随机12肽 库；PEG8000 ； IPTG,X Gal、辣根过氧化物酶标记的抗噬 菌体单克隆羊抗体（HRP anti M13,皮尔斯生物技术公 司）；血蓝蛋白.550型ELISA读数仪. 方法 模拟表位肽的筛选 噬菌体库的生物淘洗用100g/LAvas tinl50nL包被96 孔板的1个孔，4°C过夜，封闭后加入IOOpLTB ST稀释10 UL12肽库，室温作用lh，用lml/LTBST冲洗10次.加入洗 脱液（mol/LGlycine HC1, lg/LBSA） 100 u L 作用 8min，吸 出洗脱液，再用lmol/LTris HC115 u L中和上述洗脱液. 吸取1 yL洗脱液测定滴度，其余液体加入20mLLB培养基进 行扩增和纯化.按以上步骤进行第2,3轮筛选，但分别用3, 5mL/LTBST 洗涤. 阳性噬菌体的鉴定第3轮筛选完成后，挑选80个分割 良好的噬菌体克隆分别进行扩增和纯化.将纯化好的噬菌体 分别加入预先包被了 Avastin和人IL 15mAb的96孔板中， 室温作用lh;加入HRP标记的抗M13抗体，作用lh.OPD显 色，测定A490nm值，以A490nm值高于阴性对照倍作为阳性 克隆. 阳性噬菌体与Avas tin结合的剂量依赖实验以5mg/L Avastin包被96孔板，每孔10 0 y L,同时对每个Avastin包 被孔设立IL 15mAb的包被孔为阴性对照，4°C孵育过夜. 加入封闭液，4°C封闭2h，将阳性噬菌体稀释至5X10 14pfu/L 后作倍比稀释，直至其滴度为X1010pfu/L，分别加入A vastin及IL 15mAb包被孔，lOOuL/孔，室温孵育2h， 每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体m AblOOuL,室温孵 育lh，OPD显色后测定A490nm值. 阳性噬菌体单链DNA的提取及测序取5⑻uL上述噬菌 体贮液，加入 200uLPEG8000/NaCl 放置 lOmin，离心 lOmin, 弃上清，沉淀重悬于10 0 uL碘化物缓冲液中，加入250 uL 乙醇，室温作用lOOmin，离心lOOmin，弃上清，用700mL/L 乙醇洗沉淀，短暂真空干燥.沉淀重悬于3 0 u LTE (mol/LTris HC1，lmmol/LEDTA)中，取上述溶液5 y L送上海生工生物 公司测序. 人工合成12肽与Avastin结合的刻量依赖实验将不同 稀释度的合成12肽加入对应的孔中，每孔100 nL，4°C过夜； 封闭2h，将Avast in和I L 15mAb分别加入对应孔中，每 孔lOOu L，室温反应lh;每孔加入小鼠抗人IgG抗体封闭 2h. 5mL/LTBST 洗涤 3 次，每次5?lOmin.加入 10mg/LAvastin 室温孵育2h.TBST同法洗涤后，加入AP 羊抗人二抗，室 温孵育lh.洗涤后显