双偏振极化干涉技术实时研究三磷酸腺苷与其适配体相互作用.doc

双偏振极化干涉技术实时研究三磷酸腺苷与其适配体相互作用 利用双偏振极化干涉(Dual polarization interferometry, DPI)测量技术实时研究了三磷酸腺苷(AP)与其适配体(APbinding aptamer, ABA)间的相互作用。将单链ABA固定在DPI氣化硅芯片上， 采用DPI技术实时监测AP与固定的ABA的相互作用过程中敏感层的质 景、厚度、密度的变化。通过详细分析敏感层质景变化，得到AP与 ABA间的结合速率常数(ka-466 X 103 L/ (mol?s)、解离速率常数 (kd =170 X 10 ymbolm@@ 2?s ymbolm@@ 1)、结合常数(KA=27 X 105 L/raol)和解离常数(KD =37 X 10 ymbolm@@ 6 mol/L)。通过测 定敏感层质量、厚度和密度随AP浓度的变化，分别建立了测定AP的 方法，检出限(LOD, 3o)分别为022 umol/L (质量变化)、014 u mol/L (厚度变化)、032 umol/L (密度变化)。本研究利用DPI技?g 揭示了 ABA与AP相互作用中结构变化的实时信息，构建了新型AP传 感器，用于实际血清样品中AP的检测，结果令人满意。 和著作权归原 所有， 匕 关键词双偏振极化干涉；核酸适配体；三磷酸腺苷；相互作用 1引言 核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(ELEX)技术，从随机 单链寡聚核苷酸文库中筛选出的DNA或RNA寡聚核苷酸\ [1 \ ]。核酸 适配体对相关配体具有高特异性和高亲和性，与抗体相比，适配体具 右免疫原性低、靶分子范围广、价格低廉、可快速体外合成以及容易 修饰等优点。因此，基于核酸适配体构建的生物传感器在蛋白质研宄 \ [2 \ ]、药物检测\ [3 \ ]、临床诊断\[4\]等方面得到了广泛应用。 研究核酸适配体与靶分子间的相互作用过程，对于研究其相互作用机 理，构建适配体传感器，具有重要的参考意义。高效液相色谱\ [5\]、 原子力显微镜\ [6 \ ]、电泳\ [7 \ ]、聚合酶链反应\ [8 \ ]、等温滴 定量热法和荧光光谱技术\ [9,10 \ ]都被用来研究适配体和靶分子间 的相互作用过程。尽管上述技术能够在天然状态下测定二者的相互作 用信息，并且具有较高的选择性和灵敏度，但难以提供适配体与目标 物结合过程中的实时动态参数信息。近年来，表面等离子体共振 (urface plasmon resonance, PR)被广泛用于分析生物分子如蛋白 质与蛋白质\[11\]、适配体与靶标\[12\]、蛋白质与金属离子\ [13\]间等相互作用，可在线连续实时检测相互作用过程，提供实时 的动力学信息。但是PR技术仅仅是通过折射系数的变化进行测量，主 耍反映结合过程中质量的变化，无法获得生物分子的构象变化等信息。 双偏振极化干涉(Dual polarization interferometry, DPI) 测量技术是近年出现的一种新型表面分析方法。基于homas Young干 涉原理，在传感片（感应波导片和参考波导片）表面发生分子相互作 用或者吸附效应时，入射光经两个波导片，传播速率发生改变，导致 由两个波导片射出的干涉条纹位置发生变化。根据麦克斯韦方程，通 过测量相位的变化，可以获得精确的表面层厚度和折射率的变化\ [14 \]oDPI技术主要用于对表面分子间的相互作用过程进行实时监测和 定量分析，无需标记，能够高精度地测量界面层厚度（001 nm）、质量 （01 pg/mm2 ）和密度的变化\ [15\]。DPI在DNA固定和杂交\ [16 \]、蛋內质相互作用过程中的构象变化\ [17\]、DNA/蛋內质和小分 子之间的相互作用\ [18 \ ]和生物标志物的检测\ [19 \ ]等界面化 学、生物分子相互作用及定景检测等方面得到越来越多的应用，是研 究分子间相互作用的存力工具。 三磷酸腺苷（AP）在细胞代谢的调节过程中发挥了重要的作用， 为生物体中的各种生化反应，如DNA复制、生物合成、膜离子通道泵、 激素和神经元活性的调节等提供能量\ [20 \]。异常的AP水平与心血 管疾病、帕金森氏病和阿尔兹海默氏病密切相关\ [21 \]。深入丫解 AP与其相应适配体（ABA） \ [22\]间的相互作用过程及准确测定AP， 对于了解机体代谢过程、预防疾病至关重要。本研宄利用DPI技术实 时研究了 AP和ABA之间相互作用过程，获得了 AP和ABA结合过程中 的实时作用参数，如层质量、层厚度、层密度的变化信息。通过DPI 提供的动力学信息，更深入理解AP和ABA之问的相互作用，精确测定 了 APABA的结合速率和解离速率常数。H前，尚未右采用DH技术研 究