常见的第六章 分子生物学研究方法(下).ppt

6. 2. 2 高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 图6-12 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 6. 2. 3 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。 图6-14 植物基因敲除及突变体筛选 a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b，PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。 Identifiation of bard1-3 homozygous lines 6. 3 蛋白质及DNA相互作用技术 6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 将顺式作用元件与最基本启动子（minimal promoter，Pmin）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活Pmin启动子，报告基因表达。 图6-15 酵母单杂交的基本原理示意图 图6-16 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。 将不同基因或基因片段分别克隆到pYF503中(GAL4 AD 为GAL4 激活结构域, empty vector 表示无基因克隆到pYF503中), 转入酵母中表达N端带有GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白，观察报告基因表达与否。 Identification of trans-activation property of QRAP2 by yeast one-hybrid assay. Plasmid DNA from various constructs was transformed into yeast cells and the abilities of transcription activation of the recombinant protein was identified via blue/white selection. No blue color was observed in yeast cells transformed with either the empty vector (contains only the GAL4 DNA-binding domain) a full-length UBQ10 gene the C-terminus (from amino acid 113-292) of QRAP2 ligated to the GAL4 DNA-binding domain. 6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。 BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 图6-17 酵母双杂交技术原理示意图 6. 3. 3 体外蛋白质相互作用技术 1、Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。 图6-18 Far Western印迹试验 2、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 图6-19 GST融合蛋白沉降技术流程。 3、蛋白质芯