常见的神经通路示踪技术 尼式染色.ppt

神经组织的固定 （一）固定(fixation) 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性。更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原防止抗原弥散。 （二）固定剂(fixative) 醛类固定剂 双功能交联剂，使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。常用的醛类固定剂有10%钙-福尔马林液，10%中性缓冲福尔马林液，4%多聚甲醛(paraformaldehyde)磷酸缓冲液，戊二醛(Glutaraldehyde)-甲醛液，Bouin’s液等 常用的切片方法 常用的有石蜡切片法、冰冻切片法、恒冷箱切片法、振动切片法. ⒈ 石蜡切片(paraffin sectioning) 本法是将已固定的组织块常规脱水处理后，放入熔化的石蜡中浸蜡，将组织包埋在石蜡中制成蜡块，再用石蜡切片机切片(一般片厚5-10μm)，然后将切片贴于载玻片上。本法适用于一般染色方法。 ⒉ 冰冻切片(freezing sectioning) 本法是将已固定或未经固定的组织块经保护处理后，用液态二氧化碳或半导体致冷装置迅速致冷冻结变硬，然后在冰冻切片机上切片。本法可不必经脱水包埋处理，甚至可不经固定处理，故对组织细胞内的脂类成分及酶的活性影响较少，而且方法简单，制片速度快，缺点是难以切出10μm以下的薄切片。 神经组织的一般染色方法 ⒈ 尼氏法（Nissl staining） 尼氏体（Nissl body）也被称作“嗜色小体”或“虎斑小体”，其主要成份是核糖核酸（RNA）和蛋白质组成。在各种类型神经元中，尼氏体的形状、大小与分布均不相同。由于含有RNA，故易为某些碱性苯胺染料所染色（如甲苯胺蓝，焦油紫类，硫堇，天青，派洛宁，中性红以及培花青等）。本法除可显示正常神经元形态，特别是其内含的尼氏体情况外，还可显示当神经元受到损害，引致的尼氏体消失，即染色质溶解（chromatolysis），可供病理或临床诊断和实验研究参考。 神经细胞化学性质显示方法 1．组织化学方法 （1）显示脱氧核糖核酸的孚尔根反应法(Feugen reaction) 利用schiff试剂显示细胞内DNA的经典方法，其基本原理是组织经盐酸水解后打开DNA分子中脱氧核糖和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出脱氧核糖核酸中的醛基，醛基与schiff试剂中的亚硫酸品红结合，而在核内呈红色反应沉淀物。 （2）显示多糖的过碘酸-schiff反应法(Periodic acid Schiff reaction)简称PAS法，是显示组织或细胞内多糖和粘多糖成分的常用方法，其原理是通过碘酸的氧化作用，打开糖分子内1，2-乙二醇中的碳-碳键或糖中的的氨基，烃氨基衍生物，形成2-醛基，这些醛基与schiff试剂中的亚硫酸品红反应，形成紫红色化合物。 3．荧光免疫细胞化学 荧光免疫细胞化学( immunofluorescent cytochemistry)的基本原理是用荧光染料作为标记物，标记上己知的抗原或抗体，再用标记上荧光素的抗体或抗原作探针，检测细胞或组织内的相应抗原或抗体。当荧光素结合的抗体与被检抗原或抗体结合，便可用荧光显微镜检测到这此抗原或抗体的定位。 4．免疫细胞化学的双重标记（Double staining） 这一技术目的是在同一神经细胞胞体或它的突起内同时显示共存的两种或两种以上物质以研究这些物质在同一神经元或它的突起内的共存现像，或含有不同化学物质的两种结构的相互关系。 5．荧光细胞化学双标记法 荧光细胞化学双标记法的原理亦如免疫细胞化学双标记方法，只是第二抗体标记物是不同的荧光素，如呈黄绿色荧光的FITC及呈红色荧光的TRITC，可将两种不同的特异性一抗混合与切片进行孵育，但两种一抗必须来自不同种动物。然后再与标记不同荧光素的两种针对第一抗体的二抗混合孵育，使各自与一抗结合。最后在荧光显微镜下用不同的激发滤片观察到两种不同反应产物的不同的荧光。 6．免疫电镜技术 免疫电镜技术（immunoelectron microscope technique）是免疫细胞化学与电子显微技术结合的产物，用以在超微结构水平进行免疫细胞化学研究。 此技术的关键问题是标记物质必须是能满足电镜显微技术要求的电子致密物质，目前常用的为HRP、细胞色素C，近年来随着胶体金、纳米金技术的发展，更广泛的被采用作为免疫电镜的标记物。 神经胶质细胞的显示方法 过去长期以来用以显示神经胶质细胞的方法是基于Cajal镀银方法，其原理与神经细胞镀银方法相同，但效果不理想。后来镀银方法几经改进，效果有所改善。 由于免疫细胞化学的应用及进展，目前已利用针对特定神经胶质