第三章 细胞生物学研究方法培训教材.ppt

第三章  细胞生物学研究方法;第一节 细胞形态结构的观察方法;;第二节 细胞组分的分析方法;第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术;一、光学显微镜技术（light microscopy);二、 电子显微镜技术;三、 扫描遂道显微镜;;普通复式光学显微镜技术;荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）;Green Fluorescence protein，GFP ;This photograph was made with white light with no exciter filter and no barrier filter.;利用GFP进行的蛋白质的基因工程化改造;;直接荧光标记技术;间接免疫荧光标记技术;利用较短波长的光使样品受到激发产生较长波长的荧光，用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置，这种显微镜称为荧光显微镜。 根据激发光的路径不同，可将荧光显微镜分为透射式和落射式两种类型。;激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）;;;暗视野显微镜(dark field microscope) 相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 。 微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。; 原理 : 暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照射到标本的光线不能直接进入物镜，而由聚光镜周围斜射到标本上，使标本的表面产生散射光，通过目镜进入眼中，因此在黑暗的视野中呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子 。 ;电镜与光镜的比较;电镜与光镜光路图比较;电子显微镜的基本构造;主要电镜制样技术;电镜样品的染色;超薄切片的要求;;;;扫描电子显微镜;;离心分离技术;二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法;DNA特异性的显示方法 多糖的显示方法 脂类物质的显示 细胞中各种酶的显示 ;DNA特异性的显示方法;多糖的显示方法;脂类物质的显示方法;细胞中各种酶的显示方法;三、特异蛋白抗原的定位与定性; 细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。;;;四、细胞内特异核酸的定位与定性;;五、放射自显影技术;;六．定量细胞化学分析技术;一、细胞的培养;细胞培养的意义;细胞培养： 将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。 动物细胞培养的基本过程： 取材 分离细胞 选择相同类型的细胞 贴壁培养 传代;;原代培养：从机体取出后立即进行的细胞培养。 传代培养：原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长。 ;细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。这种传代细胞称为细胞株。 细胞系：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。 实验室中常用的细胞系;名称; 二、细胞工程 ;;石蜡切片的制作过程;为什么要对生物样品进行染色;;;右图所示为荧光显微镜下观察到的小肠微绒毛的图像。 荧光显微镜技术包括荧光直接标记技术和免疫荧光技术。 利用Evans蓝进行染色，这种染料在荧光的激发下可发出红色荧光。黄绿色的荧光是GLT2（一种葡萄糖转移蛋白）荧光标记抗体的染色。;;;利用不同的显微镜所观察到的神经细胞： 1）暗视野显微镜; 2）相差显微镜; c)DIC;骨骼肌细胞放大4500倍。 左图切片厚度为1μm；右图切片厚度为0.025μm。;