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第四章 抗体工程制药 Contents of chapter 4 宋朝（十一世纪）时吸入天花痂粉预防天花 ； 明代（公元十七世纪七十年代左右）接种“人痘”，预防天花； 十八世纪后叶，英国乡村医生Jenner种“牛痘”预防天花。 病原菌致病与疫苗 十九世纪中叶，显微镜的改进导致病原菌的发现； 1850年在羊的血液中看到炭疽杆菌； Pasteur证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染致病； Koch提出病原菌致病的概念； 正式认识Jenner的接种牛痘苗、预防天花的科学性和重大意义。 十九世纪八十年代后期，发现白喉杆菌经其分泌的白喉外毒素致病； 随后发现再感染者的血清中有“杀菌素”----抗体； 1890年， Behring和Kitasato用白喉抗毒素治疗白喉病人。 2、抗原 能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。 抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。 ABO血型：红细胞表面的糖蛋白末端寡糖的特点决定了它的抗原性。 3、抗体是免疫球蛋白 抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 二十世纪三十年代，Tiselius和Kabat用电泳研究血清蛋白。 动物免疫后，血清中γ-球蛋白显著增高。 γ-球蛋白有Ab活性。 1、单克隆抗体的原理 骨髓瘤细胞在体外培养能无限增殖，免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，细胞融合后形成杂交瘤细胞； HAT培养基选择性培养杂交瘤细胞； 微量蛋白质检测技术筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。 2、单克隆抗体的制备过程 抗原制备、免疫动物 免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备 细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养、杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞的克隆化 单克隆抗体的检定 分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 单克隆抗体的大量制备 动物体内诱生法 体外培养法 单克隆抗体的纯化 4.3 鼠源性单克隆抗体的改造 杂交瘤单克隆抗体均为鼠源性 大量应用于人体可产生人抗鼠抗体 改造鼠源性单克隆抗体的目的： 降低免疫原性 降低相对分子质量，增加组织通透性 一、免疫球蛋白的结构 B淋巴细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞， 浆细胞产生能与相应抗原发生特异性结合的免疫蛋白----Ab。 抗体也称为γ球蛋白。 1968年和1972年将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白。 免疫球蛋白分为分泌型（SIg）和膜型（mIg）。 SIg主要存在于血清及其他体液或外分泌液中，具有抗体的各种功能。 mIg是B细胞表面的抗原识别受体。 Ig是由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。 重链的分子量约为50～75kD，由450～550个氨基酸残基组成。 重链恒定区的氨基酸的组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。 据此将免疫球蛋白分为五类，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。 根据Ig铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，同一类Ig可分为不同的亚类。 轻链的分子量约25 kD，由214个氨基酸残基构成。 轻链分为κ(kappa)型和λ(lambda)型。 天然Ig分子上两条轻链的型别总是相同。 两型轻链的功能无差异。 不同种属中，两型轻链的比例不同。 κ:λ比例的异常可能反映免疫系统的异常 ----人类免疫球蛋白λ链过多，提示可能有产生λ链的B细胞肿瘤。 可变区 ：重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大。 高变区 ：VH和VL各有三个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化。 互补性决定区：三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面。 骨架区：高变区之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化。 恒定区：重链和轻链的C区分别称为CH和CL 。 铰链区：位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，易伸展弯曲，易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。 二、免疫球蛋白的功能区 VH和VL是结合抗原的部位。 HVR（CDR）是V区中与抗原表位互补结合的部位。 CH和CL具有部分同种异型的遗传标志。 三、免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解片段。 2个Fab段：抗原结合片段，由一条完整的轻链和重链的VH和CH1功能区组成，与抗原结合不能形成凝集反应或沉淀反应。 Fc段：可结晶片段。Fc段相当于IgG 的CH2和CH3功能区，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。Ig同种型的抗原性主要存在于Fc段。 胃蛋白酶水解片段： 双价 F(ab)′2片段：与抗原结合可发生凝集反应和沉淀反应。 pFc′： Ig的Fc段被胃蛋白酶裂解为若干小分子片段，，失去生物学