色方案抗体组合设计 ppt课件培训讲学.pptVIP

;流式细胞仪的光源和光路;光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。;;散射光测量原理;散射光的性质 ;SC;荧光信号检测原理; ;FITC荧光素的激发和发射光谱;流式常用荧光染料;荧光信号;不同的荧光素标记不同的细胞抗原。 不同的荧光素在受到激发光激发后发射出不同波长的荧光。 根据荧光波长可区分出不同细胞抗原。 根据荧光信号的强弱可反映细胞抗原的表达含量。;;XL流式细胞仪光路图;FC500流式细胞仪光路图;;流式细胞仪的电路;电脉冲信号的产生及光电管和检测系统;光电管和检测系统：放大器;检测的一般步骤;电压调节－利用同型对照：设置背景;荧光补偿;荧光补偿的调节;补偿调节－利用单标样本，来消除荧光交叉;补偿调节-最精确的全矩阵软件;数据分析;影响一个成功的多色实验的因素：;405nm;Gallios滤光片组合 ;;FITC;不同公司的荧光染料强度比较;Krome Orange;BC 荧光染料 – 染色指数;;荧光素的特性 – Crosstalk（串色）;Crosstalk Index: SN(MFI(secondary channel)) / SN(MFI(primary channel)) * 100;荧光素特性 - Crosstalk;数字化荧光补偿;未补偿: SD CV = MFI SD(pos) SD(neg) MFI(pos) MFI (neg) ;FL3;FL3;34%;405nm;405nm;荧光补偿;10 色 distortion 图谱 (Gallios, Navios) ;;;;抗原间的关系 – 互相排斥;抗原间的关系 – 共表达;抗原间的关系 – 亲代和子代;compensated ;抗原分布– 分群明显 vs 连续表达;达到最佳抗体组合的6大法则;使分析的复杂程度降到最低;;不洗涤过程;不洗涤过程加快数据分析;错误的抗体组合即使是进行洗涤也无法得到好的结果！ ;抗体组合设计很大程度上会影响你的结果！;;FITC;FITC;Let’s Do Some Sensitivity Workout !; 人的EDTA抗凝全血 单标荧光补偿抗体： CD8-FITC, CD3-PE, CD5-ECD, CD19-PC5.5， CD5-PC7，CD4-APC, CD8-APCA700，CD3-APCA750, CD3-PB, CD4-KO 10C抗体组合（验证管）：CD16-FITC,CD127-PE,CD19-ECD,CD25-PC5.5， CD56-PC7，CD4-APC,CD8-APCA700，CD3-APCA750，HLA-DR-PB,CD45-KO 溶血素;标记12支试管，分别为阴性对照，单色补偿和10色。 分别不同试管里加入对应的单色补偿试剂和10色混合试剂，阴性对照管不加抗体，室温暗处孵育15分钟 Optilyse C 溶血素溶血10分钟 加入PBS 300g离心5??钟，弃上清，加入500ul PBS上机检测。;阴性对照管调节电压，用flow-set 标准微球标准化PMT. ;;(质控血);;单标样本自动做荧光补偿。 10C结果分析。 ;;目的: 识别如下细胞群: T cells: CD8+T cells; T Regs; Na?ve and central memory CD4+T cells; Effector CD4+T cells; NK cells; NKT cells and B cells 检测活化标志: HLA-DR 染色策略:;目的: 识别如下细胞群: T cells: precursors， Na?ve and Effector Tregs; Na?ve and Central Memory CD4+T cells; Effector and Effector Memory CD4+T cells. NK cells: Immature, Mature and Regulatory NKT cells 检测CD62L和活化标志CD69 染色策略:;;已有10色方案;Thanks !