天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定..docVIP

天然的人源性核糖体展示抗体库的构建与初步鉴定 】目的构建库容量大、多样性好的核糖体展示 单链抗体；TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，兔网织红细胞裂 解液，T7RNA 聚合酶，rNT PsRNaseinhibitor； pMD18T Vector载体；RNA抽提试剂盒；脂多糖。 方法 mRNA提取和RT PCR抽取10位健康志愿者外周血， 其中男性5例，女性5例，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。 按mRNA提取试剂盒(Amersham)说明书所述步骤提取mRNA。 以Oli go(dT)为引物逆转录合成第一链c DNA,具体方法按 说明书进行。 Sc FvDNA的构建及扩增利用mRNA反转录合成cDNA第 1链，以第1链为模板，扩增抗体基因按文献扩增人类主要的 轻重链可变区基因，所有引物序列根据抗体两端相对保守的 框架区设计［2 3］。所需引物和寡核甘酸均由上海生工负责 合成。 扩增重链VH可变区引物为： VH/T7 : 5 ’ GCAGCTAA TACGACTCACTATAGGAA CAGACCACCATGAGGTSM ARCTGCAGSAGTCWGG 3 ’ VH2: 5 ’ TGAGGAGAC GGTGACCGTGGTCCCTTG GCCCC 3 ’ 其中划线部分为T7启动子序列；黑体部分所示为核糖 体结合位点。扩增VL可变区引物为: VL: 5 ’ ATTGAGCTCACCCAG TCTCCA 3 ’ Ck: 5 ’ GA ACACTCATTCCTGTTGGA GCT 3 ’ 引物中的简并碱基符号M -A/C, R-A/G, S-C/G,W :A/T，按 程序 1（30 个循环：94 °C X lmin-55°C X2min—72 °CX2min） 进行PCR,分别扩增VH和VLcDNA，对扩增产物进行纯化并测 定其浓度。Linker序列为（G ly4Ser） 3，该引物两端的各18 个碱基分别与VH和VL基因的3’端和5’端相互补。将VH、 VL和Linker等量混合后，经程序2（7个循环:94C X lmin— 63°CX4min）进行聚合反应使VH和VL籍linke rDNA连接形 成ScFvDNA。然后通过引物VH2和CK进行PCR扩增，执行程 序1，使聚合的ScFvDNA得到扩增。 核糖体展示抗体库的构建将最后纯化的核糖体ScFv 展示模板连接T Vector,用BioRad电转化仪将连接产物 转化入JM109,通过蓝白筛选，随机挑取9个克隆子，进行菌落 PCR法验证。将验证阳性的克隆子测序，分析序列，以此评 价文库序列的多样性。 核糖体展示抗体库的初步鉴定将PCR扩增的随机 ScFvDNA文库进行离体转录，37°C反应2h，回收mRNA。转 录产物再用兔网织红细胞裂解液系统进行离体翻译30°C培 育30min，于冰上放置。 将体外翻译完成的产物立即从30QC拿出，加入冰冷的 PBSMB溶液，轻轻混匀后，加入已用LPS封闭好预冷的酶联 板中，每孔50uL，冰上放置1?2h。用PBSTM冲洗3遍， 每次5min，然后用PBSM冲洗2遍，每次5miri。加入EB缓 冲液(1 XPBS缓冲液中含20mmol/LEDTA)，冰上放置lOmin, 吸取上清。重复此步骤1次。将收集的上清用RNA抽提试剂 盒(Roche)提取上清中的RNA，引物VH/T7和Ck反转录扩增 RNA得到一轮筛选后的ScFvDNA文库。将DNA文库又进行体 外转录、翻译、筛选，重复2次。得到3次筛选后的ScFvDNA 文库。分别以回收的RNA为模板进行RT PCRo 2结果 VH、VL及ScFvDNA的扩增结果扩增得到的VH和VLD NA分别约为350bp和650bp，VH、VL和linker连接后的Sc Fv片段大小为kb左右。将大量扩增的ScFvDNA通过琼脂糖 凝胶电泳回收纯化，保存于_20°C。 核糖体展示S cFv文库的构建及分析将菌落PCR验证 为阳性的9个克隆子测序。结果表明，克隆的9条ScFv序 列都是完整的，为开放阅读框，内部没有终止密码子。通过 V BASEDNAplot软件分析9条ScFv序列，其重链分别属于 VH1，VH3, VH5, VH4基因家簇，轻链分别属于VKI，VKII, VKIII亚基因家簇。根据Rabat软件分析，9条序列的重链和 轻链CDRs也均有不同程度的变化。 核糖体展示ScFv文库的初步鉴定将每轮回收得到的 RNA各取2uL进行RT PCR扩增，扩增结果见图2。从 中可以看出，第一轮筛选后回收的mRNA进行RT PCR扩增， 得到一条非常微弱的条带。而经过3轮筛选后，得到非常明 亮的扩增条带。 3 讨论 RD是蛋白质筛选的重要工具，已用于筛选配体、受体， 确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新