免疫组化技术- 免疫组化在肿瘤病理诊断中的应用教程教案.pptVIP

免疫组化结果的判断原则及对假阴性和假阳性的认识 一、 免疫组化结果的判断原则 免疫组化具有特异性强、敏感性高及定位正确等优点，但随着免疫组化应用的普及和深入，越来越多的问题也随之出现。因此，掌握对免疫组化结果的判断原则是很重要的。 1.必须设染色对照 每批染色都要以特异性的阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正确的判断。没有阳性对照，就不能做出真正阴性结果的判断；同理，没有阴性对照，也就不能做出真正阳性结果的判断。因而，没有对照的免疫组化染色，即使做出了判断也是不可信的。 2.抗原表达必须在特定部位 阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内，EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。 3.阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性结果不能认为具有否定意义；阳性表达有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。 4.免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准 当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析，不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。 二、引起假阴性和假阳性结果的原因 1.假阴性结果的原因主要是： （1）抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度； （2）由于组织自溶，抗原扩散而导致抗原消失，特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固定之标本； （3）操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高； （4）组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。 2.假阳性结果的主要原因是： （1）所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色； 免疫组化操作经验和体会 操作中应注意以下问题： 1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗涤要充分。 4.要设阴性和阳性对照。 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。 6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。 7.ABC复合物应在临用前30min配置。 8.ABC试剂保存温度以4℃ 为佳，保存达数年仍可获满意效果。 9.抗体保存：-20℃ 分装冻存，或于4℃ 常规使用，切忌反复冻融。 （一）均匀的背景染色 1.酶-底物反应时间过长。 2.在孵育中切片干燥。 3.一抗或二抗稀释度不够。 4.切片洗涤不充分。 5.封闭所用的正常血清不对。 免疫组化常遇问题 （二）部分区域背景着色 1.切片部分区域干燥。 2.显色反应物在封片介质中是可溶的，造成弥散。 （三）部分区域不着色 1.脱蜡不完全。 2.切片部分区域干燥。 （四）各种孵育结果所有抗体均不着色 1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。 2.稀释液中有错误的正常血清（如猪抗兔酶标抗体稀释液中有正常兔血清）。 3.显色反应物溶于脱水的酒精、二甲苯或封片液中。 （五）某些抗体不着色 1.需要消化而没有消化。 2.封闭内源酶时使抗体活性下降。 3.切片在裱片或干燥时过热。 4.抗体过度稀释，一抗浓度小于二抗。 5.抗体过期或频繁冻融. （六）内源性酶活性： H2O2 -甲醇封闭不恰当。 （七）脱片 1.切片无粘附试剂。 2.切片不干净。 3.冰冻切片：组织在贴片前已经充分固定。 （八）核轮廓模糊 1.切片已干燥（特别是冰冻切片）。 2.苏木素染液欠佳。 （九）非特意性色淀 1.底物-显色液使用前未经过滤。 2.抗体使用前未离心。 （十）阳性反应太弱 1.抗体或其它试剂活性下降。 2.显色反应时间过短。 3.某些抗体的稀释度或孵育时间不够。 4.当加抗体时切片上缓冲液过多。 免疫组织化学技术 西南医院病理学研究所 冯俊明 免疫组化标记的形态学特征 免疫组化标记具有形态学特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断，现择要分述如下： 一、阳性标记色度特征 免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素