cZ双报告基因真核表达载体构建和体外表达.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１）：６５～６９ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 研究简报殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 ＥＧＦＰＬａｃＺ双报告基因真核表达载体的 构建及体外表达 １ １ １ １ ２ １ 刘　莉 　周　政 　采克俊 　张易祥 　何　湃 　曹　访 （１湖州师范学院生命科学学院　湖州　３１３０００　２苏州大学生命科学学院　苏州　２１５００６） 摘要　构建（半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）双报告基因的真核表达载体，并在真 β 核细胞中表达。采用ＰＣＲ方法从质粒ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５ＧＷ／ＬａｃＺ中获取ＬａｃＺ全基因，与ｐＥＧＦＰＣ１重 组后构建真核表达载体ｐＥＧＦＰＣ１ＬａｃＺ。该重组质粒经ＰＣＲ和酶切方法鉴定后，在脂质体介导 下转染２９３ＦＴ细胞株及鸡胚成纤维细胞，通过荧光观察和组织化学方法检测Ｅｇｆｐ和ＬａｃＺ基因的 表达。结果表明，ＬａｃＺ基因被克隆到ｐＥＧＦＰＣ１，成功构建了双报告基因真核表达载体。该重组 质粒转染后的细胞呈现绿色荧光，组织化学方法检测到呈蓝色的细胞，表明两个报告基因均能在 细胞内正确表达。 关键词　 半乳糖苷酶　绿荧光蛋白　双报告基因　真核表达 β 中图分类号　Ｑ７８６ 　　 半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）基因和绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ 同样也存在不足之处，如在生物体内易受诸多因素的 β ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）基因是分子生物学及基因工程 影响，荧光观察受到干扰，影响结果判断。Ｔｉｍｍｏｎｓ 中广泛应用的两个报告基因。ＬａｃＺ基因是来自大肠杆 ［５］ 等 用ＬａｃＺ和ｇｆｐ作为报告研究果蝇基因表达时，发 菌乳糖操纵子中的一个基因，其最大优势是易于用组 现两个报告基因在果蝇不同组织的表达不同，同时指 织化学法检测其原位表达，而且其表达产物对细胞的 出可视化的ＧＦＰ荧光有利于识别活细胞中的蛋白表 存活和生长基本无毒性作用［１～２］，是最常用的报告基因 达，而ＬａｃＺ组织化学染色对于监测蛋白的原位表达更 之一。但其不足之处在于，检测后的细胞不适宜继续 灵敏。为避免单一报告基因给实验结果分析带来误 培养或是进行其他方法的检测。ＧＦＰ来源于海洋生物 差，利用ｇｆｐ作为报告基因常需要做ＧＦＰ或目的基因的 水母［３～４］，通过自催化氧化反应产生荧光团，即由Ｓｅｒ 免疫组织化学进一步鉴定，或分别用ＬａｃＺ报告基因和 ＴｙｒＧｌｙ形成的环状结构，在长波紫外或蓝光波长照射 ｇｆｐ报告基 因的进行研究，以达到相互验证 的 下发出绿色荧光。由于其基因可以在异源组织中表达 目的［６～７］。 并产生荧光，检测时不需抗体、辅因子、酶底物等其它 　　鉴于单一报告基因应用的局限性和不足，构建同 成分，不影响宿主细胞，因而可以鉴定、跟踪、分选表达 时含有ＬａｃＺ和ｇｆｐ两个报告基因的真核载体，对于准 ＧＦＰ的活细胞，ＧＦＰ近年来成为细胞生物学和分子生 确监测体内外细胞转染效果具有重要的意义。 物学中广泛应用的报告蛋白。绿色荧光蛋白报告基因 １　材料与方法 收稿日期：２００８０６２６　　修回日期：２００８０９１６ １．１　材　料 国家自然科学基金、浙江省科技计划重点项 目 ２００５Ｃ２２０５２）资助项目 １．１．１　质粒与菌株　质粒 ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５ＬａｃＺ购 自 （ 电子信箱：ｌｉｕｌｉ＠ｈｕｔｅ．ｚｊ．ｃｎ