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重楼抗菌清除自由基活性实验的研究 　　【摘 要】目的：建立体外抗菌、抗氧化的实验模型研究重楼不同部位抗菌及清除自由基活性。方法：乙醇回流提取重楼中的有效成分，系统溶剂萃取得到了乙酸乙酯、正丁醇、水三种不同极性部位，采用液体稀释法和DPPH（二苯代苦味酰肼）法研究不同部位的抗菌、抗氧化活性。结果：重楼水部位抑制细菌作用较强，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC（最小抑菌浓度）分别为7.5mg/ml，12.5mg/ml；正丁醇部位抑制真菌作用较强，对白色念珠菌的MIC为5mg/ml；乙酸乙酯部位具有较强清除自由基能力，DPPH的半数清除浓度约为1.0mg/ml，最大清除率为84.0%。结论：不同提取部位的抗菌及清除自由基活性有较大差异，重楼除正丁醇部位外的其它部位也具有良好的药理活性。 　　【关键词】重楼；自由基；抑菌活性；DPPH 　　重楼，又称七叶一枝花，是延龄草科 （Trilliaceae）， 重楼属 （Paris） 植物的泛称， 主产于我国西南各省区。重楼性味苦、微寒、有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，常用于治疗肿痛、蛇毒咬伤等症，有重要的药用价值[1]。重楼药理活性强，临床应用范围广，研究表明重楼具有较强的抗肿瘤活性[2]，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有不同程度的抑制作用[3]，近年来还有研究表明重楼有一定的抗氧化作用[4]；目前认为重楼活性成分为正丁醇部位的甾体皂苷，甾体皂苷是天然产物中一类重要的化学成分，在植物中分布较为广泛，甾体皂苷具有多种生理活性， 如抗癌、抗菌、抗氧化、消炎作用等，并且不同部位的药理活性有较大差异。目前对于重楼不同部位清除自由基与抗菌活性的研究未见报道，因此本文研究了重楼乙醇提取物各部位清除自由基与抗菌活性，初步明确清除自由基与抗菌的不同活性部位。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 　　二苯代苦味酰肼DPPH（Sigma公司）， 重楼饮片购自重庆桐君阁医药批发公司，牛肉浸膏（BR，北京奥博星生物技术责任有限公司），蛋白胨（BR，上海试剂二厂），琼脂粉（BR，Xiamen sanland chemincals company），其它试剂均为化学纯。 　　1.2 菌种 　　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans），以上菌种均由本实验室传代保种。 　　1.3 实验仪器 　　756MC型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），分析天平（FA2104N），R-205旋转蒸发器（Switzerland BUCHI），SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市舒华仪器厂），恒温培养箱（BS-1E型），超净工作台（苏净公司），粉碎机，薄层色谱GF254硅胶板（青岛海洋化工厂）。 　　1.4 方法 　　1.4.1 重楼各部位制备 　　重楼饮片粉碎后，用80%乙醇回流提取三次，减压浓缩，得乙醇总提取物。取适量用水分散，石油醚脱脂后依次用乙酸乙酯、正丁醇分别萃取5次，合并相同部分浓缩干燥，得乙酸乙酯部位、正丁醇部位、萃取后水层部位。将各部位用无水乙醇配制成浓度为200mg/ml的母液。 　　1.4.2 液体稀释法体外抑菌实验 　　将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接种于M-H牛肉浸膏平板上，将白色念珠菌接种于马丁培养基平板上，活化后配成相当于0.5麦氏管浊度的菌液。连续稀释配制成浓度为1.5625～100mg/ml系列的含药培养液，另设药液、培养基、和菌液三种对照管，在每一试管内接种相当于0.5麦氏管浊度的菌液25μl，混匀，置37℃温箱培养24h后观察有无浑浊，以不出现浑浊的最低浓度为该部位的 MIC，并于48h继续观察。共做3次平行试验。 　　1.4.3 清除DPPH?自由基活性实验 　　二苯代苦味酰肼 （1，1-dipheny1-2-picrylhydrazy） 是一种稳定的有机自由基， 通过检测试样对DPPH 自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。该方法主要利用DPPH的紫红色吸光度变化来检测试样清除自由基能力。用无水乙醇将DPPH配制浓度为6.5×10-4mol/l的储备液，将此母液稀释成不同浓度，以分光光度法分别测定A517吸光度，作标准曲线。稀释得到65μmol/L的DPPH?反应溶液，测定加药液后A517下降表示其对有机自由基消除能力。清除率越大，其抗自由基能力越强。每个处理均做三个重复。清除率（ %） = （A0 - A样）/A0 ×100 % 。A0 为未加样的 DPPH （2.5 ml DPPH + 0.5 ml无水乙醇） 的吸光度， A样为样品与 DPPH 反应后的平均吸光度。 　　2 结果 　　乙酸乙酯，正丁醇，水三个不