常见的2014-免疫学检验与临床应用.ppt

免疫学检测原理及临床应用 郭 继 强 新乡医学院免疫学教研室 免疫学检验是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术，在疾病的诊断、疗效评价中应用广泛。 细胞水平检测 第一节 免疫学检验原理 基因水平检测 分子水平检测 一、免疫细胞的检测 对机体参与免疫应答细胞进行分离、纯化、鉴定、计数及功能测定。 外周血单个核细胞的分离（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC) T细胞和B细胞的分离 DC、NK、Mφ的分离 密度梯度离心(Ficoll)离心　 （泛影酸葡甲胺-聚蔗糖） E花环沉降法 ：分离T细胞（CD2-绵羊红细胞） 尼龙毛柱分离法 ：分离T或B细胞（B细胞尼龙毛的粘附力）。 贴壁法：分离Mφ 利用细胞的吸附特性 利用细胞表面标志 T细胞：CD3，CD4，CD8 B细胞：CD79，CD19，CD5 NK：CD56+、CDl6 DC：CD11c，CD86 Mφ：CD11b，CD86，CD83 亲和版结合分离法 流式细胞术（Flow cytometry，FCM） 采用激光作为激发光源； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析。 流式细胞仪工作原理 细胞1 细胞2 Ag1 Ag2 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 密度 细胞活性 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性 流式细胞仪常检测的细胞特性 流式细胞术技术分析 免疫磁珠分离immunomagnetic beads 免疫磁珠分离的正选法和负选法 抗原肽-MHC四聚体分离技术 亲和素 抗原肽 MHC I 生物素 荧光素 淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 T淋巴细胞增殖试验 1. 原理： 淋巴细胞 DNA合成 分化 母细胞 刺激物 细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松 淋巴细胞转化的刺激物 非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞 特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原 形态学检查法 2. 方法： 细胞浆，增大，可见空泡；细胞核增大，偏一侧，核松散，可见核仁。 核仁 3H-TdR掺入法 T细胞杀伤功能测定 CTL + MTT实验 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。 原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比 MTT增殖实验 MTT增殖实验结果 吸光度 细胞数 体内试验 特异性抗原皮肤试验 抗原： 结核菌素（OT）植物血凝素（PHA） 二、B细胞功能检测 B细胞增殖能力的试验 溶血空斑试验 B细胞抗体形成功能的检测 体内试验 (一)B细胞增殖能力的试验 细菌脂多糖 B细胞增殖 形态学 3H－TdR掺入法 (二) 溶血空斑试验 1. 原理： 脾脏 绵羊红细胞 绵羊红细胞 3．临床应用与评价 溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响 评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。 酶联免疫斑点Enzyme Linked ImmunoSPOT 1.ELISPOT技术起源与发展 1983年, Czerkinsky&Sedgwick ：计数分泌抗体的 B 细胞； 1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶; 1988年，Czerkinsky et.al.: 首次将应用扩展到细胞因子检测领域，T cell IFN-γ; 同年业发展出双色标记技术； 1995年，Sc