一株抗菌活性物质产生细菌分离及鉴定.docVIP

一株抗菌活性物质产生细菌的分离及鉴定-农学论文 一株抗菌活性物质产生细菌的分离及鉴定 殷 杰，王 蒙，曾小波，马志勇，程国军 （中南民族大学生命科学学院，武汉 ４３００７４） 摘要：从根际土壤分离到一株细菌ＣＹ０４，通过电镜观察和１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列分析，发现该菌株同已知菌枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的相似度最高，为９９％， 初步认定为枯草芽孢杆菌。抑菌试验结果表明，该菌株对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）有一定的抑菌活性，对大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）和枯草芽孢杆菌没有抑菌活性。培养４８ ｈ左右是其产生抗菌活性物质的最佳时期。 关键词 ：根际土壤；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；鉴定；抑菌活性 中图分类号：Ｑ９３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０３４６－０３ ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０２２ 随着有害生物耐药性问题的加剧，微生物产生的活性成分物质在人类疾病防治、动物医药保健、植物抗病害及食品防腐等方面表现出巨大的应用潜力。枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）通过产生多种抗菌代谢产物，能有效抑制病原菌并促进动植物生长，具有较高的工业、农业以及医药应用价值［１］，同时，枯草芽孢杆菌也被认为是潜在的益生菌［２］。 目前已知枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，包括细菌素、脂肽类抗生素以及酶类、蛋白类抑菌物质等［３］。从枯草芽孢杆菌中分离的Ｆｅｎｇｙｃｉｎ能够抑制多种重要植物病原真菌的生长［４］。本研究从根际土壤样品中分离到一株能产生抗菌物质的细菌ＣＹ０４，并根据形态学特征和１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列对其进行了鉴定，初步认定其为枯草芽孢杆菌，同时对它的拮抗情况及产生原因进行了探讨。 １ 材料与方法 １．１ 抗菌活性物质产生菌种的筛选 在带有玻璃珠的三角瓶中加入根际土样１ ｇ和９９ ｍＬ蒸馏水，放置于２８ ℃摇床内振荡３０ ｍｉｎ，取样做梯度稀释后，用其涂布牛肉膏蛋白胨平板，置于３７ ℃生化培养箱中培养４８ ｈ，从中分离出细菌单株；以金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）为检测菌，采用纸片法进行菌株筛选，并对产生活性物质进行验证试验。 １．２ ＣＹ０４细菌的个体形态和电镜观察 在ＬＢ平板上观察菌落形态，利用革兰氏染色法在油镜下观察菌体形态。将菌株用戊二醛固定，ＰＢＳ洗涤和梯度乙醇脱水，真空冷冻干燥机干燥，扫描电镜观察、拍照。电镜放大倍数１５ ０００。 １．３ ＣＹ０４细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列测定和系统进化分析 用ＬＢ培养基摇床培养菌体至对数期，离心后收集菌体，抽提细菌基因组的总ＤＮＡ。以ＣＹ０４菌株基因组ＤＮＡ为模板扩增１６Ｓ ｒＤＮＡ基因片段［５］。扩增引物选用细菌通用ＰＣＲ引物１６Ｓ－Ｆ（５′ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ３′）、１６Ｓ－Ｒ（５′ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３′）。扩增程序为，９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，５６ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，３０次循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶回收，克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体［宝生物工程 （大连）有限公司］，经酶切和ＰＣＲ验证后，送北京擎科新业生物技术有限公司测序。序列提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库进行同源性比较分析。采用Ｂｉｏｅｄｉｔ和ＭＡＧＥ ４．０软件以邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建系统进化树［６］。 １．４ 菌株ＣＹ０４对不同指示菌拮抗能力的测定 以大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为指示菌，采用牛津杯（内径６ ｍｍ，外径８ ｍｍ）法测定菌株ＣＹ０４对不同指示菌拮抗能力［７］。取已活化的指示菌菌液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基，３７ ℃、２０ ｒ／ｍｉｎ培养２４ ｈ。倒牛肉膏蛋白胨平板，在每个平板的中央置一个已灭菌的牛津杯，吸取指示菌菌悬液在平板上均匀涂布，待平板晾干后进行抑菌试验。将ＣＹ０４菌株培养液离心，取上清液加入到牛津杯中，３７ ℃恒温培养箱中培养４８ ｈ，观察生长情况并测量抑菌圈直径。 将活化后的菌株ＣＹ０４按２％的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养液中，每隔６ ｈ取菌液离心，将上清液加入到牛津杯中，测定其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，确定产生活性物质的最佳时期。 １．５ 菌株ＣＹ０４的抗性测定 以抗生素卡那霉素（Ｋｍ）、氨苄青霉素（Ａｐ）、链霉素（Ｓｔｒ）、四环素（Ｔｃ）、庆大霉素（Ｇｍ）、氯霉素（Ｃｍ）、壮观霉素