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鸭绒及鹅绒制品实时荧光PCR鉴定的方法的研究 　　摘要： 　　本研究使用SDS-异硫氢酸胍-β-巯基乙醇DNA提取法提取鸭绒及鹅绒制品DNA，并建立鸭绒及鹅绒荧光PCR鉴定方法，通过对方法的特异性、检出限分析，表明方法检出限为10ng DNA（含鲑精DNA），且特异性好。通过样品检测试验表明方法稳定，所建立的方法可作为羽绒制品传统鉴定方法（显微镜法）的有力辅助。 　　关键词：羽绒；鸭绒；鹅绒；DNA；荧光PCR 　　1 引言 　　羽绒是指生长在鹅、鸭腹部呈芦花朵状的绒毛，是一种动物性蛋白质纤维，在羽绒、棉花、羊毛和蚕丝四大天然保暖材料中，羽绒的保暖性能最佳[1]。然而，目前市场上的羽绒制品价格高低悬殊，存在不少羽绒制品掺假造假现象[2-3]，现阶段，羽绒市场存在用劣质原料冒充、标示的充绒量与实际不符、蓬松度不合格、清洁度不合格等问题[4]，其中常见的用劣质原料冒充的方式有：用腈纶棉制成的假羽绒制品、用原毛制作羽绒制品、用粉碎绒（飞丝）制作的羽绒制品[5]。 　　在检测行业中，羽绒的鉴定主要依据国家标准GB/T 10288—2003《羽绒羽毛检验方法》及行业标准FZ/T 80001—2002《水洗羽毛羽绒试验方法》提供的方法，该方法是通过光学显微镜，用肉眼观察样品的显微结构，并对比标准中关于鸭绒、鹅绒及其它鸟类绒毛显微特征的文字描述和图示进行归类鉴定。该方法对检验人员要求高、主观性大，容易产生误判，使用的示意图和文字描述简单，缺乏实物标样参照，给实际检验工作带来困难[6]。有鉴于此，本研究开发了鸭绒及鹅绒制品的荧光PCR鉴定方法，以期与传统鉴定方法相结合，提高羽绒鉴定的客观性和准确度。 　　2 材料和方法 　　2.1 材料与试剂 　　2.1.1 试验材料 　　试验所用的鸭绒、鹅绒等制品来自市场购买。 　　2.1.2 试剂 　　异硫氰酸胍、聚乙烯基吡咯烷酮K-40（PVP K-40）、十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇为Amersco公司产品，鲑精DNA为Sigma公司产品，Taq酶及2×premix Ex Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司，引物及探针（表1）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　2.2 方法 　　2.2.1 DNA提取 　　挑取带毛囊的羽绒，剪取毛囊部位约0.03g样品，加入3mL 2% SDS溶液[2% SDS，50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0），20mmol/L EDTA（pH值8.0）]，65℃水浴1.5h，不时振荡；12000r/min离心5min，取上清；加入3mL羊毛提取液[4mol/L异硫氰酸胍，0.3mol/L氯化钠，4% PVP K-40，50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0），20mmol/L EDTA（pH值8.0）]及60μLβ-巯基乙醇，65℃水浴4.5h，不时振荡；12000r/min离心5min，取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清，加入1μL 10mg/mL鲑精DNA，1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH值5.2）及等体积异丙醇，-20℃沉淀过夜，12000r/min离心15min收集沉淀；小心倒去上清，用70%乙醇洗涤二次，风干；取50μL去离子水溶解沉淀。 　　2.2.2 荧光PCR检测体系建立 　　 鸭绒、鹅绒特异性荧光引物设计 　　根据家鸭、番鸭、斑嘴鸭、家鹅、鸿雁、鸡、家鸽、鹌鹑、北美火鸡的线粒体12S rDNA全基因序列设计引物和探针，在考虑引物及探针特异性的基础上，保证在引物和探针结合位点处，家鸭与其祖先种绿头鸭及斑嘴鸭序列一致，家鹅与其祖先种鸿雁序列一致。 　　 荧光PCR扩增及结果判断 　　反应体系（20μL）：2×premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.2μmol/L，探针为0.1μmol/L，模板DNA为4μL。反应程序：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。结果判断：Ct值≤35时，可判定结果为阳性；Ct值35时，可判定结果为阴性。 　　 方法特异性和检出限试验 　　以提取的家鸭、番鸭、鸭绒、鹅、鹅绒、鸡、鹌鹑、家牛、水牛、猪、绵羊、山羊、马、兔、小白鼠、鲑精DNA为扩增模板，使用鸭绒、鹅绒特异性引物和探针进行荧光PCR反应，以验证方法的特异性；并以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的模板进行荧光PCR反应，以检测方法的检出限，每个梯度做三个平行。 　　2.2.3 样品检测 　　选取18个鸭绒制品，按1.2.1的步骤提取DNA，按2.2.2进行荧光PCR反应，所使用的样品见表2。由于鹅绒制品较稀少，在市面上购买不到鹅绒制品，样品试验中不包含