烟草PHOT2基因cDNA片段克隆与RNAi表达载体构建.docVIP

烟草PHOT2基因cDNA片段的克隆与RNAi表达载体的构建-农学论文 烟草PHOT2基因cDNA片段的克隆与RNAi表达载体的构建 乔新荣１，陈 琼１，郭桥燕２，徐长水３ （１．信阳农林学院，河南 信阳 ４６４０００；２．河南省烟草公司平顶山市公司，河南 平顶山 ４６７０００；３．河南大学生命科学学院／植物逆境生物学重点实验室，河南 开封 ４７５００４） 摘要：采用生物信息学方法，以番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）ＰＨＯＴ２基因序列为探针，比对了烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）ＥＳＴ数据库，并根据获得的同源性较高的ＥＳＴ序列设计引物，ＰＣＲ扩增了烟草Ｋ３２６ ＰＨＯＴ２基因的ｃＤＮＡ片段。结果表明，成功扩增出了ＰＨＯＴ２基因的ｃＤＮＡ片段，并构建了干扰烟草ＰＨＯＴ２基因表达的ＲＮＡｉ表达载体。 关键词 ：烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）；向光素；克隆；载体 中图分类号：Q781 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０４－０981－０３ ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０４．０55 收稿日期：2014-08-08 作者简介：乔新荣（1972-），女，河南新密人，博士，讲师，主要从事植物生理及分子生物学研究，（电话）0376-6698023 （电子信?a class=“__cf_email__” href=“/cdn-cgi/l/email-protection” data-cfemail=“9b7f3832e3f2f5e9f4f5fca3abaddbaaada8b5f8f4f6”[emailprotected]。 光是调节植物生长发育的一个重要环境因子，植物中已分离了４种对不同波长光感知的受体，分别为光敏色素（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ， ＰＨＹ）［１］， 隐花色素（Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ，ＣＲＹ）［２］，向光素（Ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ， ＰＨＯＴ）［３］和Ｚｅｉｔｌｕｐｅ蛋白家族［４］，其中ＰＨＯＴ是感知蓝光的受体蛋白激酶。在模式植物拟南芥中研究表明，ＰＨＯＴ１和ＰＨＯＴ２以功能冗余方式调节弱光下的叶绿体聚积运动（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔ），使吸收光能的叶绿体面积达到最大，提高了弱光下植物的光合作用［５］。而ＰＨＯＴ２强光下单独介导叶绿体回避运动（Ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）［６］，使叶绿体从强光下移开，沿细胞垂周壁排列，与光源平行，保护光合器官免受强光损伤［７］。另外，ＰＨＯＴ２参与调节草莓果实中花青素的积累［８］。 ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ）技术通过反义ＲＮＡ与正链ＲＮＡ形成双链ＲＮＡ，特异性地降解细胞内同源ｍＲＮＡ，从而阻断靶基因的表达，使靶基因发生沉默，表现出特定基因缺失的表型。ＲＮＡｉ技术可以快速分析靶基因的功能， 这为高效研究植物功能基因组提供了方便， 成为反向遗传学研究的重要工具之一［９］。本研究以烟草Ｋ３２６为材料，克隆了烟草ＰＨＯＴ２基因片段，构建了ＲＮＡｉ干扰载体，为验证ＰＨＯＴ２介导的叶绿体回避运动是高等植物普遍的运动提供了证据，同时也为ＰＨＯＴ２可能参与烟草香气形成、烟叶品质重要调节子的研究奠定了基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 植物材料 烟草Ｋ３２６。 １．１．２ 菌种和质粒 大肠杆菌菌株ＤＨ５α，ＲＮＡｉ干扰载体ｐＦＧＣ５９４１为河南大学逆境生物学重点实验室保存；克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ购自宝生物工程（大连）有限公司。 １．１．３ 试剂 限制性内切酶、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ１８引物、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡ凝胶纯化回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；高效连接试剂盒Ｓｏｕｌｔｉｏｎ Ｉ和Ｍ－ＭＬＶ反转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶购自ＴｏＹｏＢｏ公司；抗生素（Ａｍｐ， Ｋａｎ）购自Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、普通ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ购自天根生化科技（北京）有限公司。 １．１．４ 引物 本研究使用引物见表１。 １．２ 方法 １．２．１ ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成 取烟草Ｋ３２６幼苗０．１ ｇ，液氮研磨，利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂进行ＲＮＡ提取，提取的总ＲＮＡ用ＤＮａｓｅⅠ处理去除ＤＮＡ污染，并从电泳检测其质量，合格的总ＲＮＡ进行反转录，合成ｃＤＮＡ 第一链，－２０ ℃保存备用。 １．２．２ 烟草ＰＨＯＴ２基因ｃＤＮＡ片段扩增 以番茄（Ｓｏｌａｎ