怎样才能纯化出优质的金牌抗体.doc

1.怎样才能纯化出优质的金牌抗体？ 答：首先我们要定义一下什么样的抗体才是真正的优质抗体：优质的抗体包含以下条件：1. 抗体的纯度大于95%（这里的纯度是指有效抗体的含量而不是单纯的电泳纯度）；2.抗体的活性（效价高）；3.抗体的稳定性（4℃保存10天无沉淀，-20℃保存3年以上效价无明显变化，反复冻融10次无沉淀）。 根据抗体的纯化方法可以将抗体分为二类:1粗抗体（硫酸铵沉淀、辛酸-硫铵法、盐析法等） 2．精纯法（Protein A/G、分子筛选、亲和纯化等） 根据精纯的工艺不同可以将抗体分为三类： C类抗体又叫铜牌抗体，通常纯化Protein A/G抗体； B类抗体又叫银牌抗体，通常纯化普通的亲和层析抗体； A类抗体又称金牌抗体就是我们常说的优质抗体:它就是索莱尔独立研发多年开发出的独特纯化工艺所纯化出的抗体。 1效价:130914为索莱尔自主纯化产品，130916为Protein G纯化的产品。腹水来源为同一批腹水（130426） 　 H-20(lot:130914) H-20(lot:130916) 20ug/ml 2.851 2.813 5?-1?? ? ? 2.625 2.434 5?-2 ? ? ? 1.453 1.304 5?-3?? ? ? 0.914 0.855 5?-4?? ? ? 0.477 0.436 5-5?? ? ? ? 0.324 0.206 5-6 ? ? ? 0.103 0.113 blank ? ? ? 0.084 0.078 保存条件 双硫铵法纯化的抗体 辛酸-硫酸铵法纯化的抗体 Protein G法纯化的抗体 亲和法纯化的抗体 新方法纯化的抗体 4℃存放 隔夜有大量微小沉淀 隔夜有较多微小沉淀 隔夜有少许微小沉淀 隔夜有少许微小沉淀 15-30天无明显沉淀 -20℃存放 每次冻融都有较多沉淀 每次冻融都有较多沉淀 3-5次冻融会有少许沉淀 3-5次冻融会有少许沉淀 20-30次冻融无明显沉淀 2为什么说Protein A/G的只能称之为铜牌抗体呢？ 答：首先我们剖析一下Protein A/G纯化的原理： Protein A是一种金黄色葡萄球菌(Protein G是一种链球菌株)细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合(有时结合少许IgM)，故此可以分离出IgG抗体。但是Protein A/G却无法区分特异性IgG的Fc段 还是非特异性IgG 的Fc段，故此Protein A/G纯化出的是总的IgG蛋白。 腹水腹水中含有白蛋白、y球蛋白、巨球蛋白、转铁蛋白、细胞及其残片、脂肪、小鼠的各种杂蛋白（如游离的鼠IgG、IgM），而我们真正需要的抗体只占很少的一部分（大约占15%左右）；而抗血清中的有效抗体也只占总IgG的30%左右，其余都是无关的IgG或无用的抗体；所以Protein A/G纯化的抗体看似“很纯”（电泳图）其实真正有效的 “目的抗体 ”单抗只占比75%左右，（兔）多抗只占比30%左右。 所以说用Protein A/G纯化出的抗体只能到达铜牌抗体的标准。 3为什么亲和纯化法纯化的抗体只能达到银牌抗体的标准？ 答：亲和纯化是抗体抗原的结合，理论上应该是纯度最高特异性最好的纯化方法，但是通常由于抗原的提取难度非常困难，所以获得高纯度的抗原并不是一件非常简单的事情。当我们不能获得高纯度的抗原时亲和层析做出来的的抗体也就不会那么纯了；另外亲和纯化时抗体抗原的结合比较牢固，要想分离抗体抗原就需要大幅降低洗脱液的PH值，抗体（蛋白）在这么低地PH下很容易变性失活，损伤是无法避免的。故此纯化出的抗体稳定性差，4℃保存1天就会出现少许沉淀，反复冻融很容易产生沉淀。所以普通的亲和层析纯化的抗体只能达到银牌抗体的标准，如果需要稳定性更好的优质抗体还需要更好的纯化工艺。 4为什么您纯化出的抗体效价低而且经常会有沉淀？ 答：效价低是因为特异性抗体含量少；有沉淀是因为抗体纯度不够，杂蛋白含量高，如果是亲和纯化的抗体，那么是由于纯化过程中，抗体受到了损伤，抗体的结构和性能有所改变引起的。 5为什么您用Protein A/G纯化的抗体电泳很纯但做WB时却并不理想？ 答：首先我们先研究一下电泳的原理，1． 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质HYPERLINK /view/28408.htm \t _blank 纯度的鉴定.聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和分子筛选效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出10的9次方～10的12次方的样品，且重复性好，没有HYPERLINK /view/63552.htm \t _