FM定量分析细胞增殖状态的方法.docVIP

介绍流成细胞术（Flow Cytometry）足70年代发展起来的一种利用流成细胞仪对细胞等生 物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等）进行定量、 快速、客观多参数相关检测分析的新技术。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理，同吋 利川荧光染料，激光技术，单抗技术以及计算机技术的发展，大大提高了检测速度与统计精 确性，而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数，为生物医学与临床检验学发展提供了一 个全新的视角和强有力的手段。 FCM在生命科学中的应用，标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器。 FCM的基本原理 1、 流式细胞仪系统流程： 标本—激光系统- 流动系统- 信号处理系统- 放大系统- 计算机系统-结果打印 2、 基本原理： 待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力 是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过 激光聚焦区。如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的称上荧光染料，那麽这些染料将在细 胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光，通过一定波长选择通透性的滤色片，我们 可将不同波的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管屮，经过一系列的信 号转换、放大，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统汁染上各种荧光染料的细胞各自 的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FC同时测定一个细胞上的多 种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还nJ?以利用流式的分选功能将其分选 出来，以便进一步培养、研究. 肿瘤细胞增殖检测 细胞增殖可以通过检测：细胞周期；细胞通过细胞周期的运动率；细胞周期相关蛋白； MTT传统方法. 1.DNA含量及细胞周期分析 细胞周期分析:在细胞周期（GO, Gl, S，G2, M）的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出 周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个吋 期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。 也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确 的分期：GO、Gl、S、G2、M应用于：肿瘤的旱期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的 增殖状态及周期分布和疗效监测。 细胞核DNA定量分析常用染料有PI，EB，AO等，用增殖指数PI或S百分比SPF来表示细 胞群体的增殖状态和DNA的合成速度。 S+G2/M S PI= XI00% SPF= XI00% CiO/Gl +S+G2/M CiO/Gl +S+G2/M 具体步骤： a细胞培养：取对数生长期的细胞，按lX106/mL以ImL体积接种24孔板或2mL体积接种于 6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），在特定的时间后终止培养，进行下一步的实验。 （个人体会：细胞的浓度根据自己实验的要求，但根据经验最好总细胞数在1X106以上，如 果细胞太少，接下来的漂洗和固定还会损失的，这样上机时有时会出现细胞不够） b细胞固定：离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，于4°C 固定过夜，或-20°C长期固定。(4°C过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保 存在-20°C,有资料说-20C可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是 在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完 毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响) c细胞染色：离心收集细胞，以ImL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙 锭(PI)，1 OOug/mL RNase A, 0.2% Triton X-100, 4C避光孵育30分钟。(PI 我是直接用 PBS 配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太 大的影响) d流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和 软件ModFit分析。 细胞周期中的细胞运动率： 抗溴化脲嘧啶核苷(Brdurd)技术原理Brdurd是胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，可代替前者 渗入到具有增值活性的生物细胞内，且没有太大的毒性，缺点，需要将DNA变性解链。用 途，恶性肿瘤的化疗放疗疗效评价，也可进行活体实验研宄。 这里提供两种常用的检测方法：在细胞用BrdUrd和PI标记的抗体标记后，再经溴代脱 氧尿苷(BrdUrd)进行脉冲标记。接着用Hoechst 332588、n和二苯甲酰胺标记DNA方法 用BrdUrd对细胞进行标记。 用BrdUrd进行脉冲