CDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达与其对瘢痕疙瘩成纤维细胞影响的-研究.pdfVIP

活性抑制剂的天然靶位【131。靶向hCR常用的方法有RNA干扰(I矾Ai)、反义核苷 酸技术封闭、锤头状核酶切割等。其中小干扰I矾A(siRNA)更是在哺乳动物细胞 中显示了强大的、有效的RNA干扰能力，因而化学合成的21．23核昔酸的siRNA 或质粒表达的小发夹RNA(shI矾A)被常规用于基因沉默研究。科研人员利用脂质 式有可能导致有效的、长期的基因沉默。表达shI矾A的质粒载体正被广泛用于 抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病的研究。 脂质体最常用于体外细胞的转染，以 后又被用做基因体内导入的载体。脂质体可以与DNA形成复合物，保护DNA 不被核酸酶降解，与细胞膜结合后形成内吞小体，把DNA释放到细胞浆。脂质 体由脂质双分子层组成的封闭囊泡，无毒和无免疫原性，因此成为基因治疗、 IⅢAi分子递送的重要工具，广泛受到学者的青睐。 国外研究CDC2Ll基因时，所选的对象是肿瘤患者或实验动物，没有发现 在瘢痕疙瘩方面的研究。所采取的研究方法多是RT-PCR，SNP分析，基因芯片检 测技术，分子杂交技术，单链构象多态性分析，比较基因组杂交。国内虽然有研 究CDC2Ll基因在瘢痕疙瘩中的作用，所采用的技术是比较基因组杂交技术 (CGH)，变性高效液相色谱法结合测序筛选和鉴定，但由于研究时涉及到多个 基因的作用及相互作用，不能体现其中一个基因在瘢痕疙瘩中的作用。鉴于上述 原因，本课题选择利用基因治疗策略及方法来研究单个相关基因(CDC2L1)在 瘢痕疙瘩发病机制所起的作用及其意义。 研究目的 siRNA vector构建重组质粒，利用脂 我们运用pGPU6／GFP／NeoExpression 质体转染来沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞中的hCR基因表达，以观察CDC2Ll基因 对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的影响，为研究CDC2LI基因在瘢痕疙瘩中的作用 提供可靠的依据和有效的手段。 研究方法 lCDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达水平的测定 通过q．PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞中CDC2L1 2 基因的mI矾A表达水平。 2l矾Ai重组质粒的构建 穿梭质粒的构建 number siRNA靶序列，再根据siI斟A设计原则，选择针对hCR(GenBaIlk984) 异性siI斟A靶序列。化学合成62nt寡核苷酸和它的互补链，退火、连接到 B锄Hl／Bbs siRNA Vector，构建重组穿梭 I线性化的pGPU6／GFP／NeoExpression 建方法同hCR。该质粒也用酶切和测序的方法证实。 3筛选有效的干扰质粒 通过q．PCR检测所构建的重组质粒对CDC2L1基因的抑制效率，从而选择 干扰效果较好的重组质粒为实验的干扰靶点进行下游研究。 4I州Ai重组质粒沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞的hCR基因 blot法测定 转染瘢痕疙瘩成纤维细胞，同时设立对照。绘制生长曲线、Westem CDC2L1基因的蛋白变化，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。 研究结果 l通过q．PCR检测证明 CDC2Ll基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中IIl】[必A的表达水平明显升高，是人 正常皮肤成纤维细胞中mRNA表达水平的38．85倍。 2经酶切和测序鉴定证明 shRNA表达质粒。 3通过q．PCR鉴定证明 mI玳A水 CDC2L1．1636干扰效率为67．33％，siI矾A能够有效降低CDC2L1 选择CDC2L1．1636为试验的干扰靶点进行研究。 4MTT结果显示 blot 转染的空白细胞组生长速度有明显差异，差异有统计学意(正0．05)。Westem 法测定CDC2L1基因的蛋白变化，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期，与 下降较明显，细胞凋亡数目增加有明显的差异，差异有统计学意义(p0．05)。 结论