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（文章篇）S5E48：一篇lncRNA课题设计的范本 　　最近一直后台有留言，询问一些lncRNA、circRNA等研究策略，以及如何能够看懂别人的工作，了解别人的思路。那么我推荐，看一下小张聊科研七月份公布的《科研修炼手册》，里面整理了很详细，专门有一大章节主讲lncRNA研究思路、方法。这些套路对一般科研工作者而言在研究方向上区别不是很大，研究ncRNA，circRNA，piRNA，miRNA都是适用的，或者本身它们之间都有调控关系，研究A或者B分子都是ok的。　　今天那么就来再看一篇lncRNA研究的最新文章：Long non-coding RNA GCASPC, a target of miR-17-3p, negatively regulates pyruvate carboxylase-dependent cell proliferation in gallbladder cancer，文章发表在Cancer research上，研究单位是上海市新华医院和交大医学院，以及皖南医学院第一附属医院，通讯作者是：弋矶山医院消化内科孔祥、新华医院普外科副主任王健东、主任医师全志伟，文章对lncRNA的研究堪称经典，完全可以作为学习的范文。　　研究的关键词：胆囊癌，lncRNA，miRNA　　　　背景介绍：丙酮酸羧化酶pyruvate carboxylase存在于线粒体中，参与有氧糖酵解的TCA循环。　　细胞增殖需要大量能量。图左上角，PC催化丙酮酸到草酰乙酸放出能量。PC能给肿瘤增殖提供能量。　　文章思路：　　a通过5个胆囊癌患者的癌及癌旁组织的表达谱芯片，作者发现了一些具有差异表达的lncRNA及mRNA，随后作者随机选了10个lncRNAs、8个mRNAs，b通过qRT-PCR在15对癌和癌旁样本中进行了表达验证，确定了它们表达都异常。作者挑选了一个在肿瘤组织中明显下调，而且还非常保守的分子-lncRNA-GCASPC（GBC中抑制PC相关的lncRNA）。lncRNA研究8要素中，c其中有一个定位：发现该分子IGF2R的内含子区，“相邻就有可能有关系原则”，但这次发现它们俩之间没有明显表达调控关系。d通过在线的蛋白表达能力预测，发现其无编码能力。e另外表达定位确定了GCASPC定位于胞质中。随后，通过qRT-PCR分析了131个GBC病人组织样本该lncRNA的表达量明显减弱。f接着通过干扰或过表达，在GBC细胞株中进行了功能验证，结果发现能lncRNA-GCASPC抑制细胞增殖。g另外发现该分子在肿瘤组织中低表达，且通过动物实验发现其表达与肿瘤大小相关，且与肿瘤分期、预后相关。hGCASPC表达量越高，其预后水平越好。　　作者进行GCASPC靶分子研究，通过RNA pull-down及质谱检测，发现了PC蛋白。通过过表达GCASPC发现PC蛋白的表达活性下降，但其mRNA水平没有变化，这表明该lncRNA可能是通过翻译或翻译后调控PC的表达水平。实验发现，GCASPC是促进PC蛋白降解的。通过miRDB预测了一个miR-17-3p与GCASPC配对，并通过荧光素酶报告基因验证了它们之间的结合作用，再通过干扰或过表达miR-17-3p能影响GCASPC的表达，而干扰过表达GCASPC不能引发miR-17-3p的表达变化，验证了GCASPC是miR-17-3p的靶基因。并验证了miR-17-3p的功能，敲除它也能抑制细胞增殖。　　看一下这部分内容，作者把lncRNA研究的常规方法一一做了出来。　　1、筛选分子　　2、组织中表达验证　　3、细胞及动物实验的功能验证　　4、机制研究，靶分子的功能验证　　来看内容吧：　　1、实验的临床数据统计，表明了GCASPC与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期相关　　找差异分子，验证GCASPC在癌和癌旁组织中的表达差异，与病人预后相关。　　2、细胞、动物实验　　过表达GCASPC能抑制细胞周期。敲除GCASPC能促进肿瘤生长。　　3、下游靶分子筛选及研究　　通过RNA pull-down筛到一些作用蛋白。其中挑选出PC，并验证全长的GCASPC才有与之作用的功能。随后验证了PC的功能。　　4、研究GCASPC的上游分子miR-17-3p　　首先，通过miRDB预测了一个与GCASPC配对的miR-17-3p。并通过荧光素酶报告基因验证了他们直接的结合作用。通过干扰或过表达miR-17-3p能影响GCASPC的表达，而干扰过表达GCASPC不能引发miR-17-3p的表达变化，验证了GCASPC是miR-17-3p的靶基因，最后再验证了miR-17-3p的功能。　　验证了结合作用，表达相关性。结束。That’s all. Thank