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微生物肥料高效解磷菌筛选及解磷机理剖析 　　摘要：芽孢杆菌已被广泛应用于微生物肥料的生产。以巨大芽孢杆菌11433作为出发菌株，对其进行紫外诱变，根据平板解磷圈直径与菌落直径比值进行初筛，再根据解磷能力进行复筛，并最终获得一株高效解磷菌。该菌株的摇瓶试验结果表明，发酵3 d后，pH值从7.00降到了4.03，其解磷含量可达到46.79 μg/mL，较出发菌株11433的产量提高了115.62%，且其遗传稳定性良好。以得到的高产菌11433-D作为研究对象，对其解磷机理进行分析。发现有机酸的产生促进了解磷量的提高且使发酵液pH值降低。气相色谱质谱和高效液相色谱检测发现，巨大芽孢杆菌发酵液中的主要代谢产物为葡萄糖酸、乙酸、丙酸。 　　关键词：巨大芽孢杆菌；诱变育种；解磷机理；高效液相色谱 　　中图分类号： S182文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0537-03 　　收稿日期：2015-10-21 　　基金项目：天津市科技计划（编号：14ZCZDTG0025）。 　　作者简介：任友花（1989―），女，山东临沂人，硕士研究生，主要研究方向微生物发酵制剂。E-mail：renyouhua123456@163.com。 　　通信作者：乔长晟，博士，教授，主要研究方向为生物高分子及食品生物学。Tel：（022E-mail：qiaochangsheng@。 　　磷在农业中起到重要作用，土壤有效磷的缺乏导致植物减产[1-2]。磷肥的施用能够促进各种代谢正常进行，植物生长发育良好，同时可提高植物的抗寒性和抗旱性。肥料中70%以上的水溶性磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等结合，转化为难溶性磷酸盐，很难被植物吸收利用[3]。然而巨大芽孢杆菌不但能分解有机磷物质，而且也能分解难溶性磷化合物[4]。因此，在农业上常被用来做磷细菌肥料。 　　紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的物理诱变剂。尽管几十年来，不断有各种新的诱变剂出现和应用于诱变育种，但到目前为止，经诱变处理后得到的微生物肥料高产菌中，有80%左右是通过紫外线诱变后筛选获得的。紫外线迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一[5-6]。卢金珍等研究表明，采用蒙金娜有机磷培养基对巨大芽孢杆菌进行紫外诱变，其解磷能力达到16.85 mg/mL，比出发菌株提高了117.7%[7]。 　　微生物溶解无机磷的机理复杂，研究认为，一些微生物解磷主要是其分泌质子的溶解作用，另一些猜测认为是小分子有机酸的酸溶和螯合作用。虞伟斌等研究表明，有机酸的螯合作用是解磷菌K3解磷的主要机理[8]。研究表明，巨大芽孢杆菌有机酸主要代谢产物是葡萄糖酸、乳酸和乙酸[9]。伊?]研究发现，产气肠杆菌在溶磷过程中可能是主要通过增强细胞内TCA循环而增加体系能量，从而获得较多种类和含量的有机酸[10]。 　　本试验以解磷能力较强的巨大芽孢杆菌11433为出发菌株，进行紫外诱变，获得高效解磷菌株，进而对解磷菌发酵液中的有机酸与溶磷量的关系进行了探索，为该菌株在微生物肥料中的应用提供理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1试验主要仪器（表1）和主要试剂 　　衍生化试剂：甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（色谱纯，Fluka公司），色谱纯N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA），（购自Fluka公司）；色谱纯吡啶（纯度：99.8%），购自美国Sigma公司。试验用水为Milli-Q超纯水。葡萄糖酸、乙酸、柠檬酸等标准样品，分析纯。 　　1.2菌株与培养基 　　菌种来源：巨大芽孢杆菌11433，中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.223。 　　营养琼脂培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.0～7.2，121 ℃ 20 min灭菌。 　　种子培养基：葡萄糖10 g/L，K2HPO4?3H2O 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，尿素1.5 g/L，酵母粉1 g/L，MgSO4?7H2O 041 g/L，pH值 7.0，121 ℃ 20 min灭菌。 　　无机磷发酵培养基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4?7H2O 0.3 g/L，FeSO4?7H2O 0.03 g/L，MnSO4?H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，pH值70～7.5，121 ℃ 20 min 灭菌。 　　无机磷固体培养基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4?7H2O 0.3 g/L，FeSO4?7H2