稳定表达GLP-1类似物的CHO细胞株的构建及培养工艺研究-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（５）：５２５８ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 稳定表达ＧＬＰ１类似物的ＣＨＯ细胞株的构建 及培养工艺研究 １ １ ２ １ １ ３ １ １ 张晶晶 　刘克东 　钱　凯 　缪亚娜 　蔡燕飞 　李成媛 　陈　蕴 　金　坚 （１江南大学药学院　无锡　２１４１２２　２温州大学　温州　３２５０００　３上海药明生物技术有限公司　上海　２００１３１） 摘要　胰高血糖素样肽１（Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ１，ＧＬＰ１）是一种治疗ＩＩ型糖尿病的潜在药物，针 对其在体内半衰期短和在酵母中表达的批次间不稳定等问题，课题组前期对其进行改造，成功利 用ｐＭＨ３载体在中国仓鼠卵巢（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ，ＣＨＯ）细胞中表达人血清白蛋白（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）融合蛋白ＮＧＧＨ［６×Ｈｉｓｔａｇ＋Ｅｋ＋２×ＧＬＰ１（Ａ２Ｇ）＋ＨＳＡ］。现利用新型载 体ｐｃＤＮＡ３．１，构建含融合蛋白的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１／ＮＧＧＨ，经电击转染转入ＣＨＯ细胞中。 Ｇ４１８抗性压力筛选后利用一种新型的细胞成像系统高效快速地筛选出高表达单克隆株。表达的 目的蛋白经ＷＢ（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）验证显示，产物具有ＧＬＰ１和 ＨＳＡ的双抗原性。经悬浮驯化稳定 后，通过批次筛选得到一株稳定的高表达细胞株，产量为５８ｍｇ／Ｌ。利用５ＬＡＰ２０激流式生物反应 器扩大培养重组细胞，对 ｐＨ和溶氧控制条件进行了优化。结果显示，在 ｐＨ６．８～７．４，溶氧 （ｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎ，ＤＯ）两相控制的条件下，蛋白质最终表达量可达１４８ｍｇ／Ｌ。 关键词　胰高血糖素样肽１　中国仓鼠卵巢细胞　单克隆筛选　大规模培养工艺 中图分类号　Ｑ８１９ ［４］ 　　胰高血糖素样肽１（ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ１，ＧＬＰ 一的ＧＬＰ１与ＨＳＡ融合蛋白ＧＧＨ 。ＣＨＯ细胞自身 １）是１９８４年发现的由肠道黏膜的Ｌ细胞分泌的糖调 很少分泌内源蛋白，且表达的药物蛋白的糖基化修饰 ［１］ ［５］ 节激素 。ＧＬＰ１的主要生理作用是在血糖较高时刺 和空间结构折叠等与人体的天然蛋白相似 ，因此， 激 胰腺细胞分泌胰岛素，在血糖正常时不刺激分泌 ［６］ β ＣＨＯ表达系统得到了广泛的应用 。本课题组前期对 ［２］ ＧＧＨ进行改造后，成功构建了ｐＭＨ３／ＮＧＧＨ重组质粒 胰岛素，从而避免引发低血糖 。但因其在体内半衰 期短使应用受到限制，将其突变二联体与人血清白蛋 并在ＣＨＯ细胞中表达出ＮＧＧＨ［６×Ｈｉｓｔａｇ＋Ｅｋ＋２× 白（ＨＳＡ）融合后在毕赤酵母中表达的融合蛋白ＧＧＨ， ＧＬＰ１（Ａ２Ｇ）＋ＨＳＡ］融合蛋白。这一设计研究不但提 ［３］ 高了ＧＬＰ１在体内的半衰期，而且通过体外剪切解决 成功提高了其在体内的半衰期 。但在后续研究中发 现分泌的蛋白质批次间不稳定，这可能是由Ｎ端的不 了胞内Ｎ端剪切不齐的问题，从而提高了其成药性。 均一性造成的。本课题组在融合蛋白ＧＧＨ的Ｎ端添 　　为大规模制备融合蛋白ＮＧＧＨ，构建稳定表达的工 加了６×Ｈｉｓ标签，并在其后添加肠激酶（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ， 程细胞株和其培养工艺的研究显得尤为重要。而在大