王草茎点霉叶斑病原鉴定及生物学特性.docVIP

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王草茎点霉叶斑病原鉴定及生物学特性

王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性-生物论文 王草茎点霉叶斑病病原鉴定及生物学特性 摘要:针对在广西横县发生的一种王草叶斑病害,为明确其病原种类,采用形态学和分子生物学方法进行了鉴定,并研究其生物学特性。结合致病菌的形态特征以及ITS序列系统聚类分析结果,将其鉴定为草茎点霉(Phoma herbarum)。生物学特性研究表明:该菌菌丝体适宜生长的温度为20~32 ℃,最适温度为25~28 ℃;菌丝体生长的最适pH值为5~8;菌丝体生长的最佳碳源为葡萄糖、蔗糖和甘露醇;最佳氮源为蛋白胨,而尿素则不适合菌丝体生长;光/暗交替或暗/光交替均有利于菌丝体生长;菌丝体致死温度为50 ℃,10 min。   关键词:王草;茎点霉;病原鉴定;ITS;生物学特性   中图分类号: S435.4文献标志码: A文章编号:1002-1302(2016)06-0210-05   收稿日期:2015-02-06   资助项目:公益性行业(农业)科研专项 (编号:201303057)。   作者简介:张驰成(1992—),男,安徽马鞍山人,硕士研究生,主要从事热带牧草病害调查及病原鉴定等研究。E-mail:[emailprotected]。   通信作者:贺春萍,硕士,副研究员,从事橡胶树根病的拮抗菌筛选等研究,E-mail:[emailprotected];易克贤,博士,研究员,从事热带牧草、剑麻和芦笋真菌病害与抗性遗传育种研究,E-mail:[emailprotected]。王草(Pennisetum)别称皇草、皇竹草,是以象草为母本、美洲狼尾草为父本杂交(Pennisetum purpureum×P.americanum)育种而成[1]。我国于1982年由中国热带农业科学院从哥伦比亚引进,经过多年试种选育而成,后定名为热研4号王草(Pennisetum purpureum×P.americanum cv. Reyan No.4)[2]。王草为多年生牧草,具有产量高、生长快、抗倒伏、耐干旱、抗病力强等特点,而且茎叶柔软口感好,营养丰富,以优质、高产而著称,被誉为“草中之王”[3],是各种草食性牲畜和鱼类的优质饲料。适宜在我国热带及亚热带种植,目前已经在海南、广东、广西、云南等地成功种植,是华南地区最适于集约化栽培的刈割型禾本科牧草[4]。然而,随着种植面积的不断扩大以及种植年限的延长,各种病害逐渐发生并逐年加重,很大程度上限制了包括王草在内的牧草产量及质量[5-6]。牧草病害可使牧草生长量减少,产草量降低,营养成分含量和可消化率下降,有害物质含量增加,进而导致动物日增体质量减少[7]。王草作为南方主要热带牧草之一,同样面临多种病害尤其是真菌病害的影响。   2015年5月,在广西横县出现了成片王草大规模发生叶斑病的情况,且有迅速蔓延之势。为明确其病原,本试验通过病原菌形态学检查,结合分子生物学手段对该致病菌进行了鉴定,进而对其进行了生物学特性研究,以期为当地王草叶斑病害的发生及综合防治提供理论依据。   1材料与方法   1.1材料   1.1.1 供试菌株从广西横县热研4号王草上采集病样,经室内无菌条件下分离及单孢分离纯化得到供试菌株。   1.1.2供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g,葡萄糖15~20 g,琼脂15~20 g,ddH2O定容至 1 000 mL,自然pH值;查氏琼脂培养基(Czapek):硝酸钠2 g,磷酸氢二钾1 g,硫酸镁0.5 g,氯化钾0.5 g,硫酸铁0.01 g,蔗糖30 g,琼脂15~20 g,无菌水定容至1 000 mL。上述培养基均于121 ℃高压灭菌20 min后备用。   1.1.3试剂及仪器真菌核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS)通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′)由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。Taq酶、PCR buffer、dNTPs、DNA片段回收试剂盒及T1载体等均购自北京全式金生物试剂公司,其他试剂均为国产分析纯。   1.2方法   1.2.1病样采集及病原菌分离纯化采用常规组织分离法进行病原菌的分离纯化[8]。将田间采回的发病王草叶片冲洗干净、晾干,在病健交界处剪取(2~3) mm×(2~3) mm的组织块。于超净工作台中,首先用0.1% Hgcl2溶液消毒约 1 min,然后用75%乙醇漂洗30 s,经无菌水漂洗2~3次后用灭菌滤纸吸干,置于PDA培养基中,在25 ℃条件下培养2~3 d。待菌落长出后,从其边缘挑取菌丝块,置于平板PDA培养基上进行纯化,获得分离菌株。   1.2.2病原菌形态学鉴定将分离纯化得到的病原菌接种于PDA培养基平板上,

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