1208肝素生物测定法.PDFVIP

2020 年版第一次征求意见稿 1208 肝素生物测定法 本法系用于肝素类产品的效价测定。测定方法分为抗Ⅱa 因子/抗Xa 因子效 价测定法和凝血时间测定法，凝血时间测定法又分为兔全血法、血浆复钙法、 APTT 法。 抗Ⅱa 因子/抗Xa 因子效价测定法 本法系通过微量显色法比较肝素标准品与供试品抗Ⅱa 因子和抗Xa 因子的 活性，以测定供试品的效价。 抗Ⅱa 因子测定法 试剂 （1）三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000 缓冲液（pH8.4) 取三羟甲基 氨基甲烷6.06g，氯化钠10. 23g，乙二胺四醋酸二钠2.8g，聚乙二醇6000 l.0g， 加水800ml 使溶解，用盐酸调节pH 值至8.4，用水稀释至1000ml。 （2 ）抗凝血酶溶液 取抗凝血酶（ATⅢ)，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇 6000 缓冲液（pH8.4)溶解并稀释制成每lml 中含抗凝血酶0.25IU 的溶液。 （3 ）凝血酶溶液 取凝血酶（F Ⅱa )，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000 缓冲液（pH8.4)溶解并稀释制成每lml 中约含5IU 的溶液，调整浓度使其在以三 羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000 缓冲液（pH8.4)代替肝素作为空白溶液（B 、B ） 1 2 的抗Ⅱa 因子实验中，在405nm 波长处的吸光度值在0.8〜1.0。 （4 ）发色底物溶液 取发色底物S-2238(或其他F Ⅱa 特异性发色底物），加 水制成0.003mol/L 的溶液，临用前用水稀释至0.625mmol/L 。 标准品溶液与稀释液的制备 试验当日，取肝素标准品，复溶后制成标准 品溶液。取标准品溶液适量，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000 缓冲液（pH8.4) 分别稀释制成4 个不同浓度的溶液。该浓度应在log 剂量-反应的线性范围内， 一般为每1ml 中含0.0085〜0.035IU，相邻两浓度之比值（r ）应相同。 供试品溶液与稀释液的制备 除另有规定外，按供试品的标示量或估计效 价（AT ），用三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000 缓冲液（pH8.4)，照标准品溶液 与稀释液的制备法制成4 个不同浓度的溶液，相邻两浓度之比值（r ）应与标准 品相等，供试品与标准品各剂量组的反应值应相近。 测定法 取不同浓度的标准品（S)系列溶液或供试品(T)系列溶液及上 2020 年版第一次征求意见稿 述缓冲液（B )，按B 、S 、S 、S 、S 、T 、T 、T 、T 、T 、T 、T 、T 、 1 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 S 、S 、S 、S 、B 的顺序依次向各小管中分别精密加入20〜100μl相同体积 1 2 3 4 2 (V )的上述溶液；每管精密加入相同体积(V)的抗凝血酶溶液，混匀，37°C平衡 2分钟；再精密加入凝血酶溶液适量（2V)，混匀，37°C平衡2 分钟；再精密加 入发色底物溶液适量（2V ），混匀，37°C准确保温2 分钟后，再精密加入50% 醋酸溶液适量（2V ）终止反应后，迅速冷却至室温。用适宜设备在405nm的波 长处测定各管吸光度。B 、B 两管的吸光度不得有显著性差异。以吸光度为纵 1 2 坐标，标准品系列溶液（或供试品系列溶液)浓度的对数值为横坐标分别作线性 回归，按生物检定统计法（中国药典2015年版通则1431) 中的量反应平行线原 理4×4法实验设计，计算效价及实验误差。 本法的可信限率(FL%)不得大于10%