酶标抗体抗原-雅安职业技术学院.PPT

DH2十H2O2—D十2H20 非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。 （4）加底物显色，加酸终止反应后读取A值。 （5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗原的稀释度作为工作浓度。 （3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。温育，洗涤。 （4）加底物显色，加酸终止反应后，读取A值。 （5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。 3．非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。 4．药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。 1．加样 应力求准确，并注意不可溅出和产生气泡。 2．温育 注意反应的温度和时间应按规定的要求，整块反应板的温度应一致，以防止“边缘效应” 。 3．洗涤 手工洗板是在每次温育后，将反应液吸出或甩干，然后用缓冲液洗涤2或3次，拍干。使用洗板机洗涤次数要适当增加。 因此，不需对反应液中结合和游离的酶标抗原进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变化即可推算出被测样品中抗原的含量。 印有蛋白条带的NC膜依次与特异性抗体和酶标二抗作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带染色清晰，根据SDS时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。 利用生物素的羧基加以化学修饰后可制成各种活性基团的衍生物(活化生物素)，以适合与各种生物大分子结合的需要。 酸性氨基酸含量较多，其等电点为pH值6.0，而且不带任何糖基，在检测中出现的非特异性结合明显少于卵白亲和素，正逐渐取代卵白亲和素。 最常用的技术是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）,其原理可分为夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。 当前，酶免疫技术己与形式各异、各具特点和用途的定位、定量和超微量测定的标记免疫技术融合发展，在医学和生物学中有着广泛的应用。 0 0 0.03 1:25000 0.02 0.03 0.11 1:5000 0.13 0.13 0.42 1:1000 0.1μg/ml 0 0.01 0.25 1:25000 0.01 0.12 0.91 1:5000 0.10 0.25 ＞2 1:1000 1μg/ml 0 0 0.12 1:25000 0 0.03 0.46 1:5000 0.09 0.15 1.17 1:1000 10μg/ml 阴性 弱阳性（1.5ng/ml） 强阳性（25ng/ml） 各抗原的吸光度值（A） 酶标抗体稀释度 包被抗体的浓度 返回章目录 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择 第三节 酶联免疫吸附试验 的应用和注意事项 一、 应用 1．病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊断。 2．蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。 二、注意事项 4．显色 根据试剂盒说明操作即可。 5．比色 要注意波长的选择。操作中应注意避免出现滤光片错用的问题。 第四节 其他酶标记免疫测定技术 一、均相酶免疫测定法、固相模免疫测定法等 基本原理 酶标抗原和非标记抗原具有相同的与限量抗体竞争结合的能力，而酶标抗原与抗体结合形成酶标抗原-抗体复合物后，其中的酶活性将被减弱或增强。 （一）均相酶免疫测定法 （二）非均相液相酶免疫测定法 基本原理：将酶标抗原、待检抗原与特异性抗体同时混合（平衡法），或先将待检抗原与特异性抗体混合反应一定时间后，再加入酶标抗原（非平衡法），抗原抗体反应达到平衡后，加入二抗，经离心沉淀后，将游离的酶标记物与结合的酶标记物（酶标抗原-抗体-二抗复合物）分离，弃上清液，测定沉淀物中酶的活性。待检抗原量与沉淀物中酶的活性成反比。 （三）固相膜免疫测定法 1.斑点酶免疫吸附试验 基本原理与常规ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA使用吸附蛋白质能力很强的NC 膜为固相载体，底物经酶反应后形成有色的沉淀物，使NC 膜染色。 斑点-酶联免疫吸附试验 2.免疫印迹试验 原理 抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动。将在凝胶中已经分离的蛋白质条带转移至NC腹上，选用低电压(100v)和高电流(1～2A)，通电45min转移即可完成。 免疫印迹试验 免疫印迹试验 3.重