蛋白质化学9-10.PPT

第六节：蛋白质的性质 一、蛋白质性质： 胶体性质(p299) 两性性质及等电点 (p291) 蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固 (p233,300) 蛋白质的紫外吸收 蛋白质的分子量 (p291) 蛋白质的呈色反应 蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质。在蛋白质分子中，可解离基团除了肽链末端的α-氨基和α-羧基外，主要的还是肽链上氨基酸残基的一些侧链基团， 如： ε－NH2、γ－COOH、β-COOH、咪唑基、胍基、－OH等。 pH=pI时，净电荷为零，在电场中不移动 pH＞pI时，净电荷为负，在电场中向阳极移动 pH＜pI时，净电荷为正，在电场中向阴极移动 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀. （三）蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固 2.复性 核糖核酸酶变性与复性作用 去除变性因素后，变性蛋白恢复原来的空间结构，恢复生物活性的现象。 本质—一级结构决定高级结构 变性蛋白质为什么能复性？ 在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。 加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固（coagulation）。 因此，凝固的蛋白质一定发生变性。 凝固：变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀(但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质) ，加热等因素使蛋白质变性并凝聚成块状。 沉淀类型 ① PI法 ② 盐析法 ③?有机溶剂沉淀法 ④ 重金属盐沉淀蛋白质 ⑤ 生物碱、有机酸试剂沉淀蛋白质 ⑥ 加热变性沉淀法 ⑦ 抗体对蛋白质的沉淀： 机理：夺取蛋白质颗粒上的水化膜， 降低溶液的介电常数 不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀 可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 盐析法（Salting out)(p305) 定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 半饱和硫酸铵沉淀球Pr 饱和硫酸铵沉淀清Pr 优点：Pr不变性，常用。 大部分蛋白质均含有带共轭双键的Tyr、Phe和Trp。这三种AA在280nm 附近有特征性吸收峰。在此波长范围，蛋白质的A280与其浓度成正比。利用这个性质，可以对蛋白质进行定量测定。 此外，蛋白质的肽键在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白质浓度的测定 1.根据分子组成测定最小分子量 2 .据pr的渗透压测 蛋白质分子量 用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透压达平衡时，测定其渗透压，计算分子量： 优点： 渗透压法简单、准确(10000-100000d)、且不受蛋白质分子的形状和水化程度影响 不足： 但受pH的影响，不能区别溶液中蛋白质分子是否均一 . 4.SDS—PAGE （十二烷基硫酸钠—— 聚丙烯酰胺凝胶电泳） 反应 试剂 颜色 反应基团 有此反应的Pr及AA 双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽键 所有蛋白质 Millon反应 Millon,硝酸，亚硝酸 红色 酚基