试验双缩脲法测定蛋白质浓度.PDF

实验 双缩脲法测定蛋白质浓度 实验目的 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习蛋白质含量测定的原理和方法 3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法 一 实验原理 （双缩脲）  Cu2+ 紫红色络合 碱性溶液 物 蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相 同反应，产生紫红色络合物。 蛋白质含有两个以上的肽键，因此，有 双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2 ＋形 成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的 浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸 成份无关。 在一定的实验条件下，未知样品的溶液与 标准蛋白质溶液同时反应，并于540～560nm 下比色，可以通过标准曲线法或对照法求出 未知样品的蛋白质浓度。 干扰物质： Tris 缓冲液和某些氨基酸 ，凡含有－ CONH －，－CH －NH ，－CS －NH 等 2 2 2 2 基团的物质都会产生干扰。 缺点： 灵敏度低1-20mg 优点： 快速（20-30min ） 不同蛋白质产生颜色的深浅相近 此法常用于需要快速，但并不需要十分 精确的蛋白质测定。 二 实验操作 试管编号 1　 2 3 标准蛋白（ml） — 1.0 — 样品（ml） — — 1.0 H O(ml) 2.0 1.0 1.0 2 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 室温放置30分钟，于540nm处比色 实验注意事项 1、试管要洗干净 2、取样要准确 3、加样顺序不可颠倒 4、各管试剂加完后要立即混匀 5、显色后放置时间不可太短或过长 6、仪器在使用前要预热和校准 三 分光光度法 原理：物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也 不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。根据 物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性 和定量的分析方法，常用紫外—可见分光光度法。  -2 2 4 3 5 10 nm 10 nm 10 nm 10 nm 0.1 cm 10cm 10 cm 10 cm  x 紫 红 微 无 射 射 外 外 波 线 线 线 光