血清中微卫星改变结果.doc

研究总结报告： 病例基本资料 经手术确诊，原发、初治的肺癌患者30例（如表2-1所示）。年龄47岁～74岁，平均年龄(64.6±5.4)岁。其中男18例，女12例；年龄＜60岁8例，60～70岁17例，＞70岁5例；有吸烟史12例，无吸烟史18例；鳞癌8例，腺癌22例；发生淋巴转移19人，无淋巴转移11人；根据2009年UICC国际TNM标准分类：I期NSCLC患者7例，II期患者13例，III期患者10例。收取NSCLC患者术中离肿瘤边缘＞3cm的正常肺组织作为对照组。 表2-1 患者临床信息图 患者临床及病理资料 数量（n） 百分比（%） 平均年龄（岁） （64.6±5.4） 30 男 18 60.0 女 12 40.0 年龄段 ＜60 8 26.7 60-70 17 56.7 大于70 5 16.7 病理分型 腺癌 22 73.3 鳞癌 8 26.7 PTNM分期 I期 7 23.3 II期 13 43.3 III期 10 33.3 所有患者及对照组人群均无肺部其他疾病、无免疫相关性疾病和其他肿瘤 病史，且无使用激素药物及免疫抑制剂史。本项研究经南通大学第二附属医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。 2. 实验流程与方法 2.2.1 标本收集与处理 2.2.1.1 EBC标本的收集与处理 患者采用德国Eric Jaeger公司生产的EBC收集器收集患者术前EBC，首先将收集器预冷20min，收集前嘱患者清水漱口，带鼻夹，通过咬口器平静呼吸。以正常呼吸频率和潮气量持续呼吸20～30分钟，可获得1～3ml的冷凝液，移至离心管内，立即将标本置-70°C冷冻柜内保存待测。 2.2.1.2 血清采集 EBC收集期间，同步采集静脉血液3ml，待其自行凝固后，离心后分离血清，将血清标本置-70°C冷冻柜内保存待测。 2.2.1.3 组织标本收集 取患者术中切除的新鲜肺癌组织及癌旁组织（远离癌组织＞3cm），离体后立即放入液氮中冷冻后置于-70°C冷冻柜内保存待测。 2.2.2 实验操作方法 2.2.2.1 样品DNA的提取 2.2.2.1.1组织（癌组织、癌旁组织）样品DNA的提取: （1）研钵里加入液氮，加50 mg组织材料，充分研磨。 （2）加入440 μl缓冲液AP1（必须为预热好的），盖好后使劲颠倒混匀材料和缓冲液。 （3）加4 ul RNase后，剧烈涡旋，使管底的材料也与液体混合。 （4）将混合物在65摄氏度下温浴15min，每5min中上下轻轻颠倒试管2～3次。 （5）加入130 μl缓冲液AP2，上下颠倒混匀，在冰上放置5 min。 （6）14000rpm/min离心5min。 （7）缓慢将上层液体（500 μl）置于Qiagen Mini Spin Colum中。14000rpm/min离心2min。 （8）将上步中的滤液（450 μl）吸至一新的离心管中。 （9）在溶解清液中仔细缓慢加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E，慢慢抽吸至两者充分混匀。 （10）将上步中的合液加入Dneasy Mini Spin Colum中，8000rpm/min离心1min，丢弃废液。 （11）将Dneasy Mini Spin Colum置于试剂盒提供的2ml离心管中，加入500 ul缓冲液AW，放置3～5min，8000rpm/min离心1 min，丢弃废液，收集管再用一次。 （12）Dneasy Mini Spin Colum中加入500 μl缓冲液AW，放置3～5min，14000rpm/min 离心3 min，丢弃废液，收集管再用一次。 （13）Dneasy Mini Spin Colum中加入500 μl无水乙醇，放置3～5min，14000rpm/min离心3 min，丢弃废液和收集管。 （14）在Dneasy Mini Spin Colum置于1.5离心管，吸取50 ul灭菌的去离子水加到Dneasy膜上。15，65摄氏度水浴5min，8000rpm/min离心1 min获取DNA。 2.2.2.1.2液体（血浆、EBC）标本DNA提取: （1）加20 μl Protease K到1.5ml离心管中。 （2）加200 μl的样品液。 （3）加200 μl的Buffer AL，涡旋15s。 （4）56℃温育10min，直到裂解完全。 （5）快速离心。 （6）加200μl乙醇（100%），涡旋15s，快速离心。 （7）转移混合液到Spin column（2ml收集管），8000rpm，离1 min，换新管，弃掉旧的收集管。 （8）加500 μl Buffer AW1，涡旋15s，8000rpm，离1 min，弃旧管换新管。 （9）加500 μl Buffer AW2，