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花生自身基因组原位杂交剖析 　　摘要：利用自身基因组荧光原位杂交技术，对花生（Arachis hypogaea L.）进行自身基因组原位杂交分析。结果显示，杂交信号沿所有染色体的全长分布，染色体着丝粒区、近着丝粒区和部分DAPI深染的区域存在强烈的杂交信号，染色体远端的杂交信号偏弱，染色体上存在少数未观察到杂交信号的DAPI深染区域。花生自身基因组原位杂交存在明显的非均匀染色体杂交带型，这说明基因区成簇分布在小的染色体区域并被重复序列间隔开。 　　关键词：花生（Arachis hypogaea L.）；自身基因组原位杂交；重复DNA序列；基因组组织 　　中图分类号：S565.2；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0527-03 　　高等植物核基因组的一个显著特征是含有大量的重复序列，如在玉米基因组中，重复DNA序列占85%以上[1]。重复序列是基因组大小差异和复杂性增加的主要原因[2]。根据重复序列在基因组中组织方式的不同，可初步分为串联重复序列（Tandem repetitive sequence）、散在重复序列（Dispersed repetitive sequence）和片段重复序列（Segmental duplication）。弄清不同类型重复序列沿染色体的物理分布是解析植物基因组组织和进化的关键之一。 　　全基因组测序方法是解析基因组组织和结构最准确的方法，但目前全基因组测序仅在模式植物和少数重要的作物中开展。基因组原位荧光杂交（Genomoic in situ hybridization，GISH）是荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术的一种，能直接揭示DNA序列沿染色体的分布模式，是研究基因组结构特征的方法之一。对拟南芥[3]、水稻[4-6]、大麦[7]、甘薯[8]等植物自身基因组原位杂交（self-Genomoic in situ hybridization，self-GISH）的研究表明，自身基因组原位杂交技术是揭示植物基因组中重复序列在染色体上的分布以及基因组组织的有效方法。 　　花生（Arachis hypogaea L.）是重要的植物性食用油和蛋白质来源，由花生属（Arachis）的二倍体物种杂交加倍形成的异源四倍体（2n=4X=40，AABB），基因组大小约为2 800 Mb[9]。对花生染色体核型[10]、荧光显带[11]及rDNA物理定位[12，13]已有报道，但对花生基因组重复DNA序列的组织和结构并不明晰。本研究拟用自身基因组原位杂交技术，初步揭示花生基因组重复DNA序列沿染色体的分布及与重复DNA相关联的染色质分化，为探究花生基因组的组织及结构提供更多的资料。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试材料为珍珠豆型栽培花生中花8号，购于市场。 　　1.2 方法 　　1.2.1 染色体的制备 染色体制片按Song等[14]的方法稍加改进。取生长旺盛的根尖，室温用饱和α-溴萘水溶液处理3 h后用新鲜卡诺固定液固定。用2%（质量分数）的纤维素酶和2%（质量分数）的果胶酶28 ℃酶解，经水洗、固定等步骤后采用火焰干燥法制片，-20 ℃保存备用。 　　1.2.2 基因组DNA的提取和探针标记 花生基因组DNA采用CTAB法提取。通过切口平移的方法用生物素-dUTP（biotin-11-dUTP）标记探针。切口平移标记反应体系含有基因组DNA 500 ng，DNA PolymeraseⅠ（Takara） 5 U，DNA PolymeraseⅠ的 10×Buffer 4 μL ，DNaseⅠ（Takara） 0.001 U，dATP、dGTP、dCTP各0.1 mmol，Bio- dUTP （Biotin-11-dUTP ∶ dTTP为 1∶2） 0.1 mmol，加ddH2O至40 μL，14 ℃反应2 h，加2 μL 0.5 mol/L EDTA 80 ℃保温5 min终止反应。切口平移标记的DNA片段用2%的琼脂糖检测。 　　1.2.3 原位杂交及检测 原位杂交及信号检测参照Li等[15]的方法并略作修改。染色体制片65 ℃烤片后，经Rnase A（37 ℃，1 h）处理，接着用2×SSC配制的70%甲酰胺溶液70 ℃处理2.5 min，用75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇在-20 ℃各脱水5 min，然后置室温下干燥。每张片子加入40 μL杂交液，含100 ng标记的DNA、50%的去离子甲酰胺（Sigma）、10%的硫酸葡聚糖（Sigma）、0.1% SDS、2×SSC、4 000 ng sssDNA，用22 mm×22 mm的盖玻片盖片，90 ℃共变性5 mi