生物化学 第5章 核酸(精品·公开课件).ppt

DNA变性 DNA复性 核酸的杂交 ⑷其他小分子RNA及RNA组学 除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA（small non-messenger RNAs, snmRNAs），或非编码蛋白质的RNA（non-coding RNA，ncRNA）。 ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。 snmRNAs的种类 核内小RNA(snRNA) 核仁小RNA(snoRNA) 胞质小RNA(scRNA) 催化性小RNA 小片段干涉RNA(siRNA) snmRNAs的功能 参与hnRNA和rRNA的转录后加工和转运以及基因表达过程的调控等。 小片段干扰RNA（siRNA），又称“引导RNAs”（guide RNAs）： 一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。 RNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。 ①在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割，产生具有特定长度（19-21nt）和序列的小片段RNA； ②在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。 RNA组学: RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。 5.4 核酸的理化性质 1.酸性化合物两性解离，但酸性强 电泳行为——泳向正极（pH7-8） 2.高分子性质 沉淀行为——加盐（中和电荷）；乙醇 粘度：DNA＞RNA 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S） 紫外吸收 OD260的应用 ⑴ DNA或RNA的定量 OD260＝1.0相当于 50μg/mL双链DNA 40μg/mL单链DNA（或RNA） 20μg/mL寡核苷酸 ⑵判断核酸样品的纯度 DNA纯品：OD260/OD280＝1.8 RNA纯品：OD260/OD280＝2.0 4.紫外吸收最大吸收波长： 260nm 核酸定量分析 核酸定性分析 5.变性、复性、分子杂交 ⑴DNA变性（DNA denaturation）： DNA变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。 DNA的变性(denaturation) 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 80 90 100 100% 50% OD260（254） Tm 变性温度范围 ① ② ③ ℃ 融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。 实验室常用的方法——热变性 ⑴DNA双螺旋结构(double helix model)的特点 DNA分子由两条DNA单链组成。 DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。 DNA双螺旋(B-DNA)结构的要点 ①DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链（简称DNA单链）组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5′端→3′端，而另一条链的方向为3′端→5′端。 ②嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平