大豆过氧化物酶的定向进化生物化学与分子生物学专业论文.docx

pPICZα -A-sbp 重组质粒的线性化 27 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 Pichia pastoris GS115 28 阳性 Pichia pastoris GS115 转化子的 PCR 分析检测 28 sbp 在 Pichia pastoris GS115 中的表达 29 Pichia pastoris GS115 重组菌株表达 SBP 条件优化结果 30 2.4 讨论 32 参考文献 33 第三章 大豆过氧化物酶基因随机突变文库的构建36 3.1 材 料 36 3.1.1 菌株和质粒36 3.1.2 试剂及工具酶36 3.1.3 培养基及试剂的配制36 3.1.4 仪器37 3.2 方 法 38 3.2.1 引物设计38 3.2.2 易错 PCR 条件的优化 38 3.2.3 sbp 的易错 PCR 39 3.2.4 目的基因与 pPICZα -A 的双酶切 41 3.2.5 目的基因与 pPICZα -A 的连接反应 41 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 E.coli DH5α 43 E.coli DH5α 阳性转化子中 pPICZα -A-sbp 重组质粒的鉴定 44 3.2.8 sbp 随机突变文库的鉴定 45 3.3 结果与分析 45 3.3.1 易错 PCR 条件的优化 45 3.3.2 sbp 的易错 PCR 反应 46 3.3.3 目的基因与 pPICZα -A 的双酶切 46 3.3.4 目的基因与 pPICZα -A 的连接反应 47 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 E.coli DH5α 48 E.coli DH5α 阳性转化子中 pPICZα -A-sbp 重组质粒的鉴定 48 3.3.7 随机突变文库的鉴定49 3.4 讨论 51 参考文献 52 第四章 高催化活性大豆过氧化物酶突变菌株的筛选53 4.1 试剂与仪器 53 4.1.1 试剂及工具酶53 4.1.2 菌株53 4.1.3 仪器53 4.1.4 试剂配制54 4.2 方法 55 4.2.1 突变文库转化 Pichia pastoris GS115 55 4.2.2 筛选方法的初步建立56 4.3 结果与分析 56 4.3.1 突变文库的线性化反应56 突变文库转化 Pichia pastoris GS115 57 Pichia pastoris GS115 阳性转化子的鉴定 57 4.3.4 高催化活性大豆过氧化物酶突变体的筛选 58 4.4 讨论 58 参考文献 59 附录：硕士期间发表的论文及参与的科研项目60 致 谢 61 摘 要 大 豆 过 氧 化 物 酶 (soybean peroxidase, SBP) 属于 Ⅲ 类 过 氧 化 物 酶 (EC1.11.117)，与同类过氧化物酶相比具有底物作用范围广、耐热性能高、酸碱 稳定性好、无污染、安全系数高、来源容易等优点。目前，SBP 在食品加工、生 物医学检测、工业废水处理及高分子材料合成等领域有着广泛的应用前景。同时， 作为天然酶蛋白，其催化效率、底物亲合性、稳定性等酶学性质均有待进一步提 高。本论文利用定向进化技术，将基因突变和高通量筛选相结合对大豆过氧化物 酶进行改造，拟提高其催化效率，以更好地适应工业应用要求。其中，易错 PCR 以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。主要研究内 容和成果如下： 1. 利用Invitrogen Corporation 提供的Pichia pastoris表达系统，采用电转化方 法将重组质粒pPICZα-A-sbp转化到宿主细胞Pichia pastoris GS115中，并在甲醇诱 导下成功地分泌表达了大豆过氧化物酶基因(sbp)，获得了具有生物活性的SBP。 为了使sbp在毕赤酵母中获得尽可能高的表达，实验分别在不同接种量、不 同甲醇诱导浓度、不同pH和不同诱导时间等方面进行了初步对比研究，得到了 一套较完善的Pichia pastoris GS115重组菌株表达sbp的优化条件：接种量100 ml/100 ml、甲醇添加量0.75%、诱导培养基pH 6.0、诱导时间48 h。此时SBP酶活 性为19.7 U·ml-1。为有效筛选出高催化活性SBP突变体奠定基础，并为今后发酵 罐中SBP的大规模生产提供参考。 2. 为提高大豆过氧化物酶的活性及研究该酶一级结构与酶活性间的关系， 采用连续易错PCR方法对sbp进行了2轮随机突变，将第二轮易错PCR产物与质粒 载体pPICZα-A分别进行双酶切，经T4DNA 连接酶催化连接后，CaCl2法转化重 组质粒pPICZα-A-sbp至大肠杆菌DH5α中，成功构建