成体组织干细胞来源依据的研究-发育生物学专业论文.docx

山东大学博士学位论文 摘要 目的和背景 本论文力图验证骨髓是成体组织干细胞来源的假设。近年来，成体 组织干细胞 Cadult tissue stem cel1s，ATSCs) 可塑性(pl凶.ticity)研究成为生物医 学领域研究的热点，但目前受到了质疑。不少阴性实验结果纷纷刊载出来， 包括在 Nature 、Science 上。之所以如此受关注，除了 ATSCs 的可塑性被视为 发育生物学理论的重大突破外，该特性还使得人们对今后应用 ATSCs 进行细 胞再生治疗以替代因损伤或疾病导致的组织缺损寄予厚望。目前，质疑 ATSCs 可塑性的中心问题为 ATSCs 的可塑性是自然存在，还是如同克隆动物 Dolly -样是人工现象。这一问题有两个重要方面有待阐明，一是陆续由各组织分 离得到的成体组织干细胞之间的关系，即表现出多能性的干细胞其确切身份 和来源:二是各组织干细胞是否可以在体内自主循环。众所周知，干细胞的 分化命运在很大程度上取决于所处的外部环境。某一组织干细胞要发生转分 化( transdifferentiation )必须离开原有的组织环境而迁移至新环境中。 ATSCs 可塑性研究多数为体内实验结果， ATSCs 的环境变迁是人工所为。 Dolly 及大 量克隆动物的诞生表明，即使是特化的体细胞，也可以被重新程序化，回归 至最原始的细胞分化状态，然后可以像受精卵一样从头发育，即核等价理论。 显然这在自然情况下是不会发生的。 ATSCs 可塑性研究较多的是骨髓来源的 干细胞，特别是骨髓造血干细胞( hematopoietic stem cells ，HSCs) 和间充质干细 胞 (mesenchymal s馆m cel1s. MSCs) 0 HSCs 在体内可发育分化为各种血细胞和 免疫细胞，可在外周血中循环，近来发现它还具有造血以外的发育潜能，如 分化为肌肉、肝细胞、神经细胞等。 MSCs 能否自行在体内循环尚无定论，但 其体内外均表现出较强的可塑性，分化为包括神经细胞、肌肉、肾、肺等 9 种以上、三个胚层来源的组织细胞。再者，骨髓是机体组织损伤修复的参与 者，至少其中的炎症前体细胞会出现在所有的损伤部位。为此在本课题中提 出骨髓可能是 ATSCs 来源的假设，并试图从多方面加以验证。 方法 分囚部分实验，为验证该假设寻求根关证据。拟观察自然状况下，骨 髓干细胞 Cbone marrow stem cells，BMSCs) 参与三个胚层来源组织器官的 生理更新和病理修复，以及 BMSCs 在成体组织内的循环和分布情况。在此 山东大学博士学位论文 基础之上，观察移植 BMSCs 和利用药物进行自身 BMSCs 动员对糖尿病和重 症坏死性膜腺炎的作用。 选择皮肤、心脏和膜腺分别作为外、中和内胚层来源的组织代表， 每种 组织均设正常组和损伤组 。以新西兰白兔为实验对象，从普鲁崎骨髓腔采集骨髓， 密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞 (monocyte of bone marrow，MBM) ，然 后根据体外生长贴壁行为的差异，分为悬浮生长的骨髓 HSCs 和贴壁生长的 MSCs 。利用活细胞核荧光染料 Hoechst33258 对三组 BMSCs (MBM，HSCs 和 MSCs) 进行核标记，是通过将染料与细胞在体外共同孵育 15min，之后以PBS 充分洗涤细胞以除去未结合的染料 。标记好的骨髓细胞分 别 回植于各自的骨 髓腔 t 3d 后复制梅应的组织损伤模型。 皮肤损伤是通过全皮肤层的剪切造成，心脏损伤是 ip 剂量为 5m g/kg 的盐 酸异丙肾上腺素 (isopenaline ，ISO)诱发，膜腺损伤是采用 ip 剂量为 lmglkg 的 L-精氨酸所致 。在复制模型 2w 后，处死各动物，用?令 PBS 进行心脏灌注后，采 集正常及损伤的皮肤、心脏和膜腺，进行冰冻切片，荧光显微镜下观察组织中有 否荧光标记的骨髓来源干细胞。选择有荧光的切片，进 行相应组织的免疫荧光染 色。皮肤切片进行 Pan Cytoker创in 免疫荧光染色，以观察 BMSCs 是否分化为表 皮细胞;对心肌组织切片进行 a -actin 免疫荧光染色，以观察 BMSCs 是否分化 为心肌细胞;对膜腺切片进行 CK19、膜岛素和膜高血糖素的免疫荧光染色，以 观察 BMSCs 是否分化为膜腺干细胞、膜岛的。和 α 细胞。 BMSCs 的体内组织分布。将产自一窝的雄性和雌性小鼠分别作为 BMSCs 的供体和受体。将 BMSCs 分为 MBM 、HSCs 和 MSCs ，分别通过尾静脉注射移 植给受体雌鼠，每只约 107 个细胞。在移植 2w 后，处死受体雌鼠 e 先用冷 PBS 进行心脏灌注，再