成年大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞分离培养及其多能性鉴定-外科学(骨外)专业论文.docx

英文缩略词表 英文缩写 ACM 英文全称 astrocytes conditional medium 中文全称 星形胶质细胞条件培养基 AST bFGF BrdU CNS EDTA EGF astrocyte basic fibril growth factor 5-bromodeoxyuridine central nervous system ethylene diamine tetraacetic acid epidermal growth factor 星形胶质细胞 碱性成纤维细胞生长因子 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 中枢神经系统 乙二胺四乙酸 表皮生长因子 ENSC endogenous neural stem cell 内源性神经干细胞 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 FITC GFAP fluorescein isothiocyanate glial fibrillary acidic protein 异硫氰酸荧光素 胶质纤维酸性蛋白 IFP iPS MAP-2 NSC RAS rpm SPF TNF-α TRITC intermediate filament protein induced pluripotent stem cell microtubule associated Protein 2 neural stem cell reactive astrocyte revolutions per minute specific pathogen free tumor necrosis factorα tetramethylrhodamine isothiocyanate 中间丝蛋白 诱导多能干细胞 微球相关蛋白 2 神经干细胞 反应性星形胶质细胞 转每分钟 无特定病原体 α 肿瘤坏死因子 四甲基异硫氰酸罗丹明 成年大鼠脊髓损伤后反应性星形胶质细胞分离培养及 其多能性鉴定 摘 要 目的 分离、培养脊髓损伤后激活的星形胶质细胞，探索反应性星形胶质细胞培 养体系，研究反应性星形胶质细胞的干细胞特性，为脊髓损伤后神经修复提供新 的途径； 方法 SD 大鼠行 Allen’s 打击法脊髓损伤模型制备后一周，切取脊髓组织，以补 充表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及 B27 的 DMEM/F12 细胞培养基对激活 的星形胶质细胞原代培养；切取正常大鼠脊髓，以 DMEM/F12 细胞培养基培养正常 星形胶质细胞，再行划伤诱导反应性星形胶质细胞生成；分别在第三代上述培养 的反应性星形胶质细胞的培养基中添加 BrdU 并免疫荧光鉴定其增殖情况；对培养 至第三代反应性星形胶质细胞行 nestin/GFAP 细胞免疫荧光双标鉴定；分别对培 养至第三代反应性星形胶质细胞进行诱导分化培养并应用细胞免疫荧光鉴定分化 后细胞表达 GFAP、MAP-2 及 RIP 情况；Western Blot 鉴定划痕后细胞表达 nestin 及 GFAP; 结果 原代培养的正常星形胶质细胞可贴壁生长，原代培养的反应性星形胶质细 胞可悬浮于培养基中生长；培养至第三代反应性星形胶质细胞在其培养基中添加 BrdU 后可见其表达，免疫荧光双鉴定显示直接由体内分离培养的以及划痕诱导培 养出的第三代反应性星形胶质细胞表达 nestin+/GFAP+；对体内分离培养的反应性 星形胶质细胞诱导分化后免疫荧光鉴定显示大部分细胞表达 GFAP、少量细胞表达 MAP-2 及 RIP；通过划痕诱导产生的反应性星形胶质细胞诱导分化后细胞免疫荧光 显示大部分细胞表达 GFAP、部分细胞表达 RIP，但未见明显 MAP-2 及 RIP 表达； Western Blot 鉴定划痕后不同时间点的反应性星形胶质细胞表达 GFAP 及 nestin， 一周内随时间延长，nestin 表达增加，GFAP 表达增加； 结论 脊髓损伤后星形胶质细胞可被激活产生反应性星形胶质细胞，反应性星形 胶质细胞可表达干细胞的特异性标志物 nestin 及星形胶质细胞的特异性标志物 GFAP；诱导分化后产生星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，说明反应性星形 胶质细胞可能获得了神经干细胞的特性，可能为脊髓损伤的临床治疗提供一个新 的途径； 关键词 反应性星形胶质细胞；脊髓损伤；神经干细胞；胶质纤维酸性蛋白；巢 蛋白 Separation and Culturing Reactive Astrocytes in Injured Adult Rats Spinal Cord and Identification of Their Pluripotency Abstract Objective To separate and culture the activated astrocytes in