番茄上三种主要病原细菌的高通量检测植物保护学;植物病理学专业论文.docxVIP

福建 福建农林大学硕士学位论文 i iii HYPERLINK \l _bookmark0 2.5.4 反向斑点杂交检测的灵敏度 19 HYPERLINK \l _bookmark1 3 结果与分析 20 HYPERLINK \l _bookmark2 3.1 滚环扩增体系的建立 20 HYPERLINK \l _bookmark3 3.1.1 番茄 3 种细菌性病原菌 DNA 的提取 20 HYPERLINK \l _bookmark4 3.1.2 滚环扩增体系的优化 20 HYPERLINK \l _bookmark5 3.1.3 滚环扩增体系的特异性测定 24 HYPERLINK \l _bookmark6 3.1.4 滚环扩增体系的灵敏度测定 26 HYPERLINK \l _bookmark7 3.1.5 CMM、PST 和 RS 的混合检测 27 HYPERLINK \l _bookmark8 3.2 反向斑点杂交 28 HYPERLINK \l _bookmark9 3.2.1 锁式探针 PCR 产物的地高辛标记 28 HYPERLINK \l _bookmark10 3.2.2 反向斑点杂交的特异性检测 28 HYPERLINK \l _bookmark11 3.2.3 反向斑点杂交的灵敏度检测 29 HYPERLINK \l _bookmark12 4 结论与讨论 30 HYPERLINK \l _bookmark13 4.1 结论 30 HYPERLINK \l _bookmark14 4.2 锁式探针设计方面 31 HYPERLINK \l _bookmark15 4.3 滚环扩增体系的优化 32 HYPERLINK \l _bookmark16 4.4 反向斑点杂交 32 HYPERLINK \l _bookmark17 5 展望 33 HYPERLINK \l _bookmark18 参考文献 34 HYPERLINK \l _bookmark19 致谢 41 PAGE PAGE 10 摘要 以 番茄 上危害较大的 3 种 病原细菌 : 番茄细菌性溃疡病菌 Clavibacter michiganense subsp. michiganse(CMM)、番茄细菌性斑点病菌 Pseudomonas syringae pv. tomato(PST)和番茄青枯病菌 Ralstonia solanacearum(RS)为研究对象，分别以这 3 种细菌的基因片段作为靶标序列，以小鼠 xist 基因中的两段序列作为连接序列，根 据设计原则设计锁式探针以及通用引物,优化并建立滚环扩增检测体系，并与常规 PCR 进行对比，比较二者的灵敏度和特异性；之后针对这 3 种病原细菌，建立起基 于锁式探针的反向斑点杂交技术体系，并测试其灵敏度和特异性。 研究结果表明，根据番茄溃疡、番茄斑点、番茄青枯病原菌的特异序列和锁式 探针的设计原则，设计出的 3 条锁式探针，通过对其特异性和灵敏度的检测，表明 设计的这 3 条锁式探针特异性好，灵敏度高，可以实现对靶标序列的特异性检测； 优化后的滚环扩增的体系，可以特异性地检测出这 3 种病原菌，而检测不出其他的 病原菌，而且滚环扩增的灵敏度达到 500fg/μL，比常规 PCR 高出 1 个数量级；结合 地高辛标记的滚环扩增与反向斑点杂交技术，成功地检测出混合的 3 种番茄病原细 菌，从而为这 3 种病原物的检测建立了新的方法，初步实现了对番茄细菌性病害的 高通量检测。 关键词：番茄病原细菌 锁式探针 滚环扩增 反向斑点杂交 高通量 Abstract As the bacterial pathogens of Clavibacter michiganense subsp. michiganse (CMM), Pseudomonas syringae pv.tomato (PST) and Ralstonia solanacearum (RS) could cause serious diseases of tomato, the padlock probe for CMM, PST and RS was designed respectively based on the species-specific DNA fragment in their complete genome. While the universal primers which came from Xist gene of mice were designed according to the linking sequence in the middle of