大乳头水螅fascin基因的克隆、生物信息学分析及原核表达-生物化学与分子生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合安徽师范大学硕士学 位论文质量要求。 答辩委员会签名： 主席：（工作单位、职称） 委员： 导师： II 大乳头水螅 fascin 基因的克隆、生物信 息学分析及原核表达 摘要 Fascin（聚束蛋白）是一类结构独特且进化保守的肌动蛋白交联蛋白， 能够参与肌动蛋白束的形成及肌动蛋白的组装。聚束蛋白与细胞表面各种 突起（如细胞伪足）的形成、细胞粘附及细胞的迁移运动等生命活动密切 相关，医学研究还表明聚束蛋白与多种癌症的发生有一定的关联。近期完 成的水螅基因组计划研究结果显示水螅也具有fascin基因类似基因，而水 螅fascin蛋白生理功能目前未知、值得深入探讨。基于此，本研究针对大 乳头水螅fascin基因进行了以下实验工作： 1.提取大乳头水螅总RNA，采用SMART 技术制备大乳头水螅RACE cDNA 文 库，再以该文库为模板扩增了大乳头水螅fascin基因cDNA 序列，PCR产物 纯化后与克隆载体pMD-18T连接，转化E.coli JM109菌株。运用菌落PCR方 法鉴定阳性克隆后进行DNA测序，测序结果表明大乳头水螅fascin基因 cDNA 序列编码区全长序列为1485个核苷酸，编码495个氨基酸。大乳头水 螅fascin基因cDNA序列的成功克隆为深入探讨fascin基因的分子进化及 水螅fascin蛋白的生理功能奠定了基础。 2. 基于原核表达质粒pET-LT多酶切位点的特点设计引物，以已克隆获得 的pMD18-T-fascin重组质粒为模板，PCR扩增大乳头水螅fascin基因片段 （编码区cDNA序列的第4位点至1071位点），再把该基因片段的PCR产物 纯化后连接到原核表达质粒pET-LT上，构建重组表达载体pET-LT-fascin， 转化E.coli BL21（DE3）菌株，IPTG诱导表达重组蛋白。SDS胶检测 结果表明本实验成功表达了重组水螅fascin蛋白，并且该重组蛋白的主要 存在形式为包涵体。本实验获得的重组水螅fascin蛋白将有助于后续制备 fascin蛋白的抗体及利用分子免疫方法研究fascin蛋白在水螅体内的表 达模式和表达动态等科研工作的开展。 关键词：大乳头水螅；fascin基因；分子进化；原核表达 III Gene cloning, bioinformatic analysis and prokaryotic expression of fascin in Hydra magnipapillata Abstract Fascin is a kind of conservative actin crosslinking protein with special structure in evolution, and participates in the formation of actin bundles and actin assembly. Fascin has been thought to be the key element of the formation of various protuberances such as cellular pseudopod on the cell surface, cell adhesion and migration. In addition, recent medical research also shows fascin is closely related to a variety of cancers. Recently completed hydra genome project showed that there was fascin homologue in the hydra, however the physiological functions of hydra fascin gene and protein have not been studied. Firstly, the total RNA of Hydra magnipapillata was extracted, and RACE cDNA library was prepared based on SMART technology. The hydra fascin gene was amplified from cDNA library, the purified PCR products were ligated with pMD-18T vector, then transformed into E. coli JM109 strain. Colony PCR met