大乳头水螅forkhead基因的克隆、生物信息学分析及原核表达-生物化学与分子生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合安徽师范大学硕士学 位论文质量要求。 答辩委员会签名： 主席：（工作单位、职称） 委员： 导师： II 大乳头水螅 forkhead 基因的克隆、 生物信息学分析及原核表达 摘 要 Forkhead蛋白为一种能通过转录调控来影响动物的胚胎发育、细胞增 殖与分化、细胞凋亡以及免疫等过程的转录因子。近期完成的水螅核基因 组测序项目结果显示，水螅也具有脊椎动物forkhead基因的同源基因。在 高等动物中，forkhead蛋白是一种直接参与调控动物胚胎发育的重要转录 因子，而水螅forkhead蛋白生理功能目前未知、值得深入研究。基于此， 本研究围绕大乳头水螅forkhead基因进行了以下实验工作： 1.提取大乳头水螅总RNA，采用SMART 技术制备大乳头水螅RACE cDNA 文 库，再以该文库为模板扩增了大乳头水螅forkhead基因cDNA 序列，PCR产 物纯化后与克隆载体pMD-18T连接，转化E.coli JM109菌株。运用菌落PCR 方法鉴定阳性克隆后进行DNA测序，测序结果表明大乳头水螅forkhead基 因cDNA 序列编码区全长序列为963个核苷酸，编码321个氨基酸。大乳头 水螅forkhead基因cDNA序列的成功克隆为深入探讨forkhead基因的分子 进化及水螅forkhead蛋白的生理功能奠定了基础。 2. 基于原核表达质粒pET-LT多酶切位点的特点设计引物，以已克隆获得 的pMD18-T-forkhead重组质粒为模板，PCR扩增大乳头水螅forkhead基因 片段（编码区cDNA序列的第7位点至963位点），再把该基因片段的PCR产 物 纯 化 后 连 接 到 原 核 表 达 质 粒 pET-LT 上 ， 构 建 重 组 表 达 载 体 pET-LT-forkhead，转化E.coli BL21（DE3）菌株，IPTG诱导表达重组蛋 白。SDS胶检测结果表明本实验成功表达了重组水螅forkhead蛋白， 并且该重组蛋白的主要存在形式为可溶性蛋白。本实验获得的重组水螅 forkhead蛋白将有助于后续制备forkhead蛋白的抗体及利用分子免疫方 法研究forkhead蛋白在水螅体内的表达模式和表达动态等科研工作的开 展。 关键词：大乳头水螅；forkhead基因；分子进化；原核表达 III Cloning, bioinformatic analysis and prokaryotic expression of forkhead gene in Hydra magnipapillata Abstract Forkhead is an important transcription factor which could control and influence animal embryonic development, cell proliferation and differentiation, apoptosis and immunity by regulating transcriptional processes. Recently completed hydra genome project showed that hydra also has a homologue of vertebrate forkhead gene. In higher animals, forkhead protein is directly involved in regulating embryonic development, however the physiological functions of hydra forkhead protein is currently unknown and deserves further study. Firstly, the total RNA of Hydra magnipapillata was extracted, and RACE cDNA library was prepared based on SMART technology. The hydra forkhead gene was amplified from cDNA library, the purified PCR products were ligated with pMD-18T vector, then transformed into E. coli JM109 strain. Colony PCR method was used for identifying the positive clones, a